慢病毒介导Cdx2基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制-论文.pdf

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1、2220实用医学杂志2014年第3O卷第14期慢病毒介导Cdx2基因过表达抑制人胃癌MGC一803细胞增殖的分子机制张笑石韦尉元罗文曹稳珑严林海谢玉波肖强摘要目的：探讨Cdx2基因过表达对胃癌细胞周期凋亡相关基因Skp2、Survivin、Bcl一2和Bax表达的影响．及其抑制人胃癌MGC．803细胞增殖的分子机制。方法：利用携带Cdx2基因的重组慢病毒颗粒(LV．CDX2．GFP)、空载体慢病毒颗粒(LV．GFP)感染人胃癌MGC一803细胞，分剐作为实验组(LV—CDX2．GFP)、阴性对照组(LV．GFP)，未转染处理的人胃癌MG

2、c．803细胞作为空白对照组，以上三组细胞按照常规培养，应用RT．PCR和Westrenblot技术检测细胞中Skp2、Bax、Bc1．2以及Survivin基因的mRNA和蛋白的表达。结果：与LV．GFP组和空白对照组比较。LV．Cdx2．GFP组人胃癌MGC．803细胞Skp2、Bc1．2和Survivin基因的mRNA和蛋白的表达降低(P<0．05)，Bax基因的mRNA和蛋白的表达上调(P<0．05)，而LV．GFP组和空白对照组比较，差异无统计学意义(P>O．05)。结论：慢病毒介导Cdx2基因过表达抑制人胃癌MGC．803细

3、胞增殖。其分子机制可能通过Cdx2调控Skp2、Survivin、Bc1．2和Bax基因表达，进而启动下游相关信号通路有关。关键词胃肿瘤；MGC．803细胞；Cdx2；过表达在我国．胃癌的发病率及死亡率在恶性肿瘤中1．2．1细胞培养与基因转染人胃癌MGC．803细仍较高⋯，而胃癌的发生发展是一个多因素相互作胞用含10％(体积分数)胎牛血清DMEM培养液培用的过程。尾型同源盒基因2(Cdx2)是在肠道特异养，在37℃、5％(体积分数)的CO培养箱中培养。性表达的转录因子与肠上皮增生、分化及表型的维隔天细胞换液。取对数生长期细胞接种于6孔板

4、持密切相关_2]。我们前期研究发现，Cdx2过表达在中．3．5×104个／孔，用不含抗生素的10％DMEM体内外明显抑制胃癌细胞株的增殖和生长能力[3-4]，培养液培养，观察待细胞融合度达40％～60％时，但机制尚明确。因此，本实验通过重组慢病毒颗粒按慢病毒转染说明书操作，以Cdx2基因过表达重介导Cdx2基因过表达转染人胃癌MGC．803细胞，组慢病毒颗粒(LV—Cdx2．GFP)和对照慢病毒颗粒观察对周期凋亡相关基因Skp2、Bax、Bcl一2和(LV—GFP)分别感染人胃癌MGC．803细胞，作为实Survivin表达的影响，初步

5、探讨Cdx2过表达抑制人验组(LV—Cdx2一GFP组)和阴性对照组(LV．GFP组)，胃癌MGC．803细胞增殖的分子机制。空白对照组细胞不做任何处理，三组常规培养。待l材料与方法细胞长满孔板。常规消化收集细胞样本。1．1材料含Cdx2基因过表达的重组慢病毒颗1．2．2RT．PCR检测人胃癌MGC一803细胞Cdx2、粒由Genechem公司构建。兔抗人一抗HA抗体购Skp2、Bax、Bcl一2和Survivin基因mRNA的表达用自SantaCruz公司．羊抗兔二抗IgG抗体购自PierceTrizol法提取各组细胞的总RNA。按逆

6、转录试剂盒公司。人胃癌MGC．803购自中国科学院细胞库(上说明逆转录获取cDNA，行PCR扩增。Cdx2上游引海)。Tfizol试剂购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒物：5。CGCCGCAGAACTrCGTCA．3下游引物：5．购自中国上海生工生物公司。细胞培养基RPMITCCGCATCCACTCGCACA一3．长度432bp。退火温1640及胎牛血清购自Gibco公司。度6OoC：Skp2上i青竽弓l物：5一GCTGCTAAAGGTCTCT1．2方法GGTGT一3下游引物：5．AGGC，ITI1AGATrCTGCAACrlT

7、G．3．，长度291bp，退火温度60℃；Bax上游引物：5一CCAAGAAGCTGAGCGAGTGT．3下游引物：doi：10．3969／j．issn．1006-5725．2014．14．011基金项目：国家自然科学基金(编号：81060201)；广西科学技5一CCGGAGGAAGTCCAATGTC．3。长度269bp，退术攻关项目(编号：桂科攻1298003—2—6)；广西自然科学基金(编火温度55oC；Bc1．2上游引物：5．GAc1rrCGCCGAG号：2011GXNSFA018273)ATGTCCAG一3下游引物：5．CATC

8、CCAGCCTCCGT作者单位：530021南宁市，广西医科大学第一附属医院胃肠TATCC．3，长度259bp。退火温度62oC；Survivin上腺体外科(张笑石，韦尉元，罗文，曹稳珑，严林海，肖强)，麻