NU7026对肝癌细胞放射增敏作用及机制研究-论文.pdf

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1、第31卷第6期辐射研究与辐射工艺学报Vo1．31，No．62013年12月J．Radiat．Res．Radiat．Process．December2013NU7026对肝癌细胞放射增敏作用及机制研究黄波龙颖唐艳肖方竹让蔚清周平坤(南华大学公共卫生学院衡阳421001)摘要为给研制新的抗癌和放射增敏药物提供理论依据，采用Westernblot检测DNA—PKcs在肝癌细胞中的表达水平及NU7026对DNA—PKcs活性的影响，以彗星实验表达检测细胞DNA受损的情况，微核实验观察染色体损伤，克隆形成实验观察对细胞株放射敏感性的影响。结果表明，DNA．PK

2、cs在肝癌细胞中呈高表达，NU7026能抑制辐射所诱发的p-DNA—PKcs／S2056的活化，微核实验及彗星实验检测表明，NU7026能有效延长辐照后细胞的修复时问，并能明显降低放射后细胞的克隆形成率。提示NU7026对肝癌细胞有放射增敏作用，其作用机制与抑制DNA．PKcs活性有关。关键词NU7026，放射增敏，DNA．PKcs，DNA修复中图分类号R735．7，TL71肝癌是危害居民生命健康的前3位最主要恶性v射线辐照前加入终浓度为20gmol·L叫的肿瘤之-[。约70％一80％的肝癌患者需要接受放射NU7026)。治疗。肝癌恶性程度高，易转移

3、、复发，手术切除将辐照后12h的3组细胞常规消化后，吹打分的病人中约50％会出现复发或远处转移L2J。提高肿散成单个细胞，0．075mol·L1KC1液低渗离心，以瘤对放射治疗的敏感性，提高其治疗效果，成为肿甲醇：冰醋酸=3：1固定30min，离心，弃上清，瘤放射治疗研究领域中的重点。本工作主要研究加入少许固定液，混匀细胞，滴2-3滴于玻片上，NU7026对人肝癌细胞HepG2增殖、DNA．PKcs表自然晾干，吉姆萨染色5—30min，冲洗后晾干，镜达及细胞辐射敏感性的影响，为该化合物开发成为检。一种有效的抗癌和辐射增敏药物提供理论依据。1．3Wes

4、ternBlot检测DNA．PKcs蛋白表达1材料与方法将指数生长的LO2和HepG2用PBS洗涤两次，常规消化细胞，离心后收集细胞(约1×10。)1．1材料于1．5mLEP管中，加入100gL蛋白裂解液室温裂肝癌细胞(HepG2)~ll正常肝细胞(LO2)由本解8min后，13000r·min离心10min，收集上清实验室保存，在含10％胎牛血清的DMEM于1．5mLEP管中，一70℃保存备用。(Dulbecco’Smodifiedeaglemedium，Gibco公司)Westernblot检测DNA．PKcs蛋白表达，用培养液中37℃、5％CO

5、2培养箱中培养。NU7026J3-actin作为内参。具体步骤：按每样本每孔100g(C17H15NO3，吗啡啉类物质，Sigma公司)、总蛋白量上样，5％SDS．PAGE凝胶电泳，80V恒DNA—PKcs抗体(SantaCruz公司)、DNA．PKcs压转膜3h，室温TBST洗膜5min，以含5％脱脂(pS2056)(Abcam公司1、H2AX(Ser139)(CST奶粉的TBST室温封闭lh，TBST洗膜5min重复公司)。3次。根据蛋白Marker将膜剪成两部分，一部分用于检测13-actin，另一部分用于DNA—PKcs，用TBST1．2微核

6、实验分别按1：1000稀释[3-actin抗体和DNA—PKcs抗实验分为未照射组(HepG2)、照射组(HepG2体，均为室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次8min；+4Gy1，射线辐照)和加药照射组(HepG2在4Gy用TBST按1：4000稀释二抗，室温孵育50min，基金项目：国家863项目(2012AA063501)、国家自然科学基金(81272994)和湖南省教育厅科研基金12C0364资助第一作者：黄波，男，1974年9月出生，2005年于南华大学获硕士学位，副教授，研究方向为放射医学防护通讯作者：周平坤，博士，教授，E—mail：z

7、houpk@bmi．ac．cn收稿日期：初稿2013-04—24，修回2013—05—27辐射研究与辐射工艺学报2013，31：060201(5)室温TBST洗膜3次，每次8min，ECL显色检测液；取1001％正常熔点琼脂糖滴至磨砂玻片上，各细胞中13-actin蛋白和DNA—PKcs蛋白含量的变4℃冷却10min；取105×10mL细胞悬液与化。60低熔点的琼脂糖混匀滴在第一层琼脂糖上，4℃冷却10min；在第二层上再滴上60此低熔点的1．4检测DNA．PKcs磷酸化位点S2056的表达琼脂糖，放于4℃冷却10min；将玻片放入4℃细HepG2细

8、胞在照射前2h加入20gmol-L‘。胞裂解液中裂解2h；用0．5％TBE(pH=8．2—8．5)NU702