单细胞克隆肝癌干细胞向间充质样细胞的分化潜能-论文.pdf

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中国肿瘤生物治疗杂志http：／／www．biother．orgChinJCancerBiother，Jun．2014，Vo1．21，No．3·245·doi：10．3872／j．issn．1007-385X．2014．03．002·研究快报·单细胞克隆肝癌干细胞向间充质样细胞的分化潜能刘虹麟，彭亮，王在，许世清，娄晋宁，冉宇靓，杨治华，王培刚，张文健(1．卫生部中日友好医院临床医学研究所，北京100029；2．中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021；3．中国科学院生物物理所蛋白质与多肽重点实验室，北京100101)[摘要】目的：探讨单细胞克隆肝癌干细胞(1ivercancerstemcell，LCSCs)向间充质样细胞分化的潜能。方法：通过有限稀释法获得单个细胞来源的LCSC克隆，采用RT—PCR法鉴定干细胞标志物；将该单细胞克隆分别用成骨、软骨和脂肪诱导分化培养基培养3周后，采用Real—timePCR及特殊染色技术比较诱导前后LCSC表达成骨、软骨及脂肪细胞特异标志物的差异。结果：单细胞克隆的LCSC表达多种干细胞标志物、干细胞因子(stemcelfactor，SCF)、干细胞因子受体、C—kit、巢蛋白(nes—tin)、CD34、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP．bindingcassettesub．familyGmember2，ABCG2)、CD133。分化诱导培养3周后，成骨方向诱导的细胞茜素红染色呈现橘红色钙结节形成，软骨方向诱导的细胞阿尔新蓝染色显示蓝色蛋白多糖沉积，脂肪方向诱导的细胞油红O染色显示大量脂滴形成。Real—timePCR结果显示，诱导后成骨细胞特异标志物骨钙素和I型胶原、软骨细胞特异标志物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原、脂肪细胞特异标志物脂联素和过氧化物酶体增殖物激活受体的mRNA表达均较对照组显著上调(I型及Ⅱ型胶原间为P<0．05，其他指标间均为P<0．01)。结论：LCSC具有可塑性，在特定的微环境下具有向间充质样细胞分化的潜能。[关键词]肝癌干细胞；单细胞克隆；间充质样细胞；多向分化潜能；可塑性[中图分类号]R735．7；R730．2[文献标志码]A[文章编号]1007—385X(2014)03-0245-06Mesenchymaldifferentiationpotentialofsingle—cellclonedlivercancerstemcellsLiuHonglin，PengLiang，WangZai，XuShiqing，LouJinning，RanYuliang，rangZhihua，WangPeigang，ZhangWenjian(1．InstituteofClinicalMedicalSciences，China—JapanFriendshipHospital，Beijing100029，China；2．CancerInstitute，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100021，China；3．KeyLaboratoryofProteinsandPeptidePharmaceuticals，BiophysicsInstitute，ChineseAcademyofScience，Beijing100101，China)[Abstract]Objective：Toinvestigatethemuhilineagedifferentiationpotentialofsingle·cell—clonedlivercancerstemcells(LCSCs)．Methods：SinglecellclonedLCSCsweregeneratedbylimitingdilutioncloningandconfirmedbyRT—PCRanalysisofstemcellmarkers．Phenotype—confirmedLCSCswereinducedtodifferentiateintoosteoblasts，chondro-cytesandadipocytes，respectively，byculturingthemincorrespondingdifferentiation—inducingmediafor3weeks．Bothbeforeandafterthedifferentiationinductionculture，theexpressionofmarkersspecificforosteoblasts，chondrocytesandadipocyteswascomparativelyanalyzedbyreal-timePCRandcelltype—specificstainingtechniques．Results：StemcellmarkersincludingCD133，CD34，ATP—bindingcassettesub—familyGmember2(ABCG2)，nestin，stemcellfactor(SCF)andstemcellgrowthfactorreceptor(C-kit)weredetectedinundifferentiatedsinglecellclonedLCSCs．Afterthreeweeksofdifferentiationinduction，cellsculturedintheosteoblast-specificmediumformedorangecalciumnodulesasdemonstratedbyAlizarinredstaining；cellsculturedinthechondrocyte—specificmediumshowedblueproteoglycandeposi一[基金项目]国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(No．2009CB521804)；国家自然科学基金资助项目(No．81370873，No．81302334)。ProjectsupposedbytheMajorNationalBasicResearchDevelopmentProgram(973program)ofChina(No．2009CB521804)，andtheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No．81370873，No．81302334)[作者简介]刘虹麟(1976一)，女，贵州省遵义市人，博士，助理研究员，主要从事肿瘤微血管内皮细胞的特性、肿瘤干细胞生物学特性的研究。E—mail：honglinl2003@163．con[通信作者]王培刚(WangPeigang，correspondingauthor)，E-mail：peigangwang@gmail．com；张文健(ZhangWenjian，co·correspondingauthor)，E—mail：zwj-72@163．com。△为共同通信作者。[优先发表]http：／／www．cnki．net／kcms／doi／10．3872／j．issn．1007-385X．2014．03．002．html ·246·中国肿瘤生物治疗杂志，2014年6月，21(3)tionsasrevealedbyAlcianbluestaining；andcellsculturedintheadipocyte—specificmediumshowedOilRedOstainedlipiddroplets．Inthethreecorrespondingdifferentiationinductioncultures，LCSCsacquiredtheexpressionofmarkersforosteoblast(osteocalcinandcollagen)，chondrocyte(aggrecanandcollagentypeII)，andadipocyte(adiponectinandperoxisomeproliferator-activatedreceptor)respectively．Allthedifferencesweresignificant(P<0．01)exceptforcolla—gentypeIandcollagentypeII(P<0．05)．Conclusion：ThesepreliminaryobservationssuggestthatsinglecellclonedLCSCspossessaplasticityandmaypotentiallydifferentiateintomesenchymal—likecellsunderspecificmicroenvironments．[Keywords]livercancerstemcell(LCSC)；single-cellclone；mesenchymal-likecell；muhilineagedifferentiationpotential；plasticity[ChinJCancerBiother，2014，21(3)：245-250]肿瘤是一种干细胞疾病，肿瘤干细胞(cancer取试剂盒购自美国Qiagen公司，逆转录试剂盒购白stemcell，CSC)在肿瘤的发生、发展、转移和复发中发美国Promega公司，Real—timePCR试剂盒SYBR挥着重要的作用。目前，已在包括肝癌在内的多种肿PremixEXTaq购自日本TAKARA公司。瘤中证实了CSC的存在引。以CSC为靶点的抗肿1．2LCSC的培养瘤治疗将成为很有前景的肿瘤治疗策略。因此，深入LCSC培养于DMEM／F12培养基，添加1％胎理解CSC的生物学特征对阐明肿瘤发生、发展和转牛血清、1：50比例的B27、20ng／mlEGF、10ng／ml移的机制，形成新的诊断和治疗策略具有重要意bFGF、100ml内皮生长因子、2mg／ml肝素、2义J。多向分化潜能是CSC的重要特征，多项研mmol／L谷氨酰胺、100U／ml青霉素、100g／ml链究刮表明，CSC可以分化成不同类型的细胞。对肾霉素、5g／ml胰岛素和0．5g／ml氢化可的松。癌和乳腺癌的研究显示，通过诱导CSC分化以减1．3单细胞克隆LCSC的分离及鉴定少肿瘤组织中干细胞的数量，同时增加其对放化疗的通过有限稀释法筛选单细胞克隆，单细胞克隆敏感性已成为肿瘤治疗的新方向。但肝癌干细胞是的生长速度存在差异，部分克隆不能持续生长而死否具有分化为间充质样细胞的潜能尚未见报道。亡。Driessens等及本课题组前期研究_1。。发现，由于CSC是异质性的群体j，故其多向分化潜增殖较快的克隆更能代表CSC。因此，本研究挑选能的研究首先要排除研究对象本身就存在具有不同增殖较快的一个克隆作为研究对象，并通过RT．表型的细胞群体。本研究中，为了排除因干细胞异PCR对干性标志物做进一步的验证。质性导致不同分化的可能，采用单细胞克隆的肝癌1．4RT—PCR检测LCSC干细胞标志物的表达干细胞(1ivercancerstemcell，LCSC)为研究对象，分采用Rneasy试剂盒提取细胞总RNA，采用Pro—析其向间充质样细胞方向分化的能力，以阐明LCSCmega逆转录试剂盒进行逆转录，RT．PCR检测干细的多向分化潜能，为诱导CSC分化的抗肿瘤治疗策胞标志物干细胞因子(stemcellfactor，SCF)、干细胞略提供重要的实验数据。生长因子受体(C—kit)、巢蛋白(Nestin)、CD34、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP．binding1材料与方法cassettesub—familyGmember2，ABCG2)和CD133在1．1细胞株及主要试剂单克隆的LCSC的表达，引物序列见表1。LCSC株分离于人原发性肝癌组织，本课题组前1．5LCSC向成骨细胞的分化期研究中已进行了LCSC特性的鉴定并保存。将细胞按6×10／孔接种于24孔培养板。8个DMEM／F12培养基、FBS购自美国Gibco公司，碱性孔作为实验组，更换含成骨诱导添加剂(100~mol／L成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，地塞米松、10mol／L3-磷酸甘油、50mol／L维生素bFGF)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)C)的新鲜培养基。另取8孔对照，更换不加成骨添和B27购自美国Invitrogen公司。超低黏附培养板购加剂的新鲜培养液作为未诱导组。每周更换2次培自美国Coming公司。茜素红染色、阿尔新蓝染色及养基，于第2l天取部分孔内细胞提取RNA，以Rea1．油红O染色试剂盒均购自美国GenmedScientific公timePCR检测成骨细胞标志物的表达。另一部分司。地塞米松、8．甘油磷酸钠、维生素C、3．异丁基．1．孔进行茜素红染色：吸弃培养液，加清理液清洗细胞甲基黄嘌呤(3-isobuty1．1-methy1．xanthine，IBMX)、吲后弃掉，加入固定液室温固定10min，洗涤3次，加哚美辛(indomethacin)购自美国Sigma公司。RNA提入茜素红染色液(室温)10min，小心吸弃染色液，空 刘虹麟，等．单细胞克隆肝癌干细胞向间充质样细胞的分化潜能气中晾干。显微镜下观察细胞样本中橘红色钙沉积室温10min，清理～液清洗3次，加入一脱水一液室温～5一情况。min，吸弃后重复脱水步骤1次，然后加入油红O染色1．6LCSC向软骨细胞的分化液室温8min，吸弃染色液，用清理液室温2min，重复将细胞按6×10／孔接种于24孔培养板，8个孔染色2次，于显微镜下观察细胞样本中的脂滴。作为实验组更换含软骨诱导添加剂(10mg／L1．8Rea1．timePCR检测诱导后LCSC中成骨、软骨TGF一13)的新鲜培养基。另取8孔对照，更换不加软和脂肪细胞标志分子的表达骨添加剂的新鲜培养液，作为未诱导组。以后每周换采用RNeasy试剂盒提取细胞总RNA并进行逆2次培养基，培养3周后进行阿尔新蓝染色和Rea1转录获取cDNA，采用SYBRGreenPCR试剂盒，按timePCR检测软骨细胞标志物的表达。阿尔新蓝染照ABIPRISM7500系统两步法进行PCR扩增，分色步骤按说明书进行：吸弃培养液，用清理液清洗细别检测向间充质诱导分化后的LCSC中成骨细胞标胞后，加入酸I生液室温3min，弃掉酸I生液后再次用清志物骨钙素(osteocalcin)和I型胶原(collagenI)、理液清洗3次，加入阿尔新蓝染色液A，室温避光孵软骨细胞标志物蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型胶原育40min，小心吸弃染色液A，加入清理液清洗2次。(collagenⅡ)、脂肪细胞标志物脂联素(adiponectin)显微镜下观察细胞样本中蓝色黏多糖蛋白的情况。和过氧化物酶体增殖物激活受体^y(peroxisomepro—liferator-activatedreceptor，PPAR)的表达。以表1人干细胞标志物PCR引物序列GAPDH~为内参，各基因特异的引物序列见表2。Tab．1SequencesofPCRprimersfor反应结束后确认实时定量PCR的扩增曲线和融解humanstemcellmarkers曲线，计算目的基因与GAPDH的Ct值之差(即GeneSequenceAct)，诱导前后基因mRNA的表达水平根据2也Forward：5一TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC一3计算。由于上述几个标志物基因表达水平非常低，Reverse：5．GCACAGCTYCTCCTrAATGTCACGC．3为使结果数据清晰明了，最终检测结果数据以Forward：5．CTCCTAnTI1AATCCTCTCGTC．3ACt／2也的形式表示。实验重复3次。Reverse：5一TACTACCATCTCGCITATCCA一3Forward：5一GGCTCTTCTCAACCATCTGTG．3Reverse：5．ArI’ITGCCGGTGTTGGTGGCTT一3表2间充质细胞相关基因PCR引物序列Forward：5一ACAACCTTGAAGCCTAGCCTG．3Tab．2SequencesofPCRprimersforReverse：5．CAAGACCAGCAGTAGACACTG．3mesenchymalcells-relatedgenesForward：5．GGCCTCAGGAAGAC兀IATGT。3GeneSequenceofprimersReverse：5一AAGGAGGTGGTGTAGCTGAT．3Forward：5．AGAGGGGAA兀ICCTGGAG．3OsteocalcinForward：5一CACTCCTCGCCCTATrGGC一3Reverse：5一CTGAGGACCAGGACTCTCTA-3Reverse：5一CCCTCCTGCTTGGACACAAAG一3Forward：5一CCTTGTGGCAAAGCTCAACC．3CollagenIForward：5．ATCAACCGGAGGAAI’ITCCGT一3Reverse：5．TCACCTCCTCTCTCACCCAG一3Reverse：5．CACCAGGACGACCAGGTI’ITC-3AggrecanForward：5一GTGCCTATCAGGACAAGGTCT一31．7LCSC向脂肪细胞的分化Reverse：5一GATGCCTITCACCACGACTTC一3将细胞按6×10。／孔的细胞密度接种于24孔培CollagenI1Forward：5一CCAGATGACCTTCCTACGCC一3养板，待细胞90％汇合时，加入含1Ixmol／L的地塞米Reverse：5．TTCAGGGCAGTGTACGTGAAC-3松、0．5mmol／L的IBMX、2~mol／L的胰岛素、0．2AdiponectinForward：5一AACATGCCCATTCGCmACC．3mmol／L的吲哚美辛的高糖DMEM诱导3d，再用含2Reverse：5一TAGGCAAAGTAGTACAGCCCA一3v,mol／L的胰岛素、10％FBS的高糖DMEM处理1d，PPARForward：5．rCrCTCCGTAA11GGAAGACC一3循环3次后，用含2Ixmol／L的胰岛素、体积分数为Reverse：5一CAIATGAGACATCCCCAC一310％FBS的高糖DMEM处理继续培养8d，每3d换GApDHForward：5CTGCACCACCAACTGCTI’AG_3液1次。另取8孔对照，加入仅含2I~mol／L的胰岛Reverse：5一GAGCTI'CCCICAGCTCAG一3素，10％FBS的高糖DMEM的未诱导组，每隔3d换液1次。诱导结束后分别进行油红O染色和Real—timePCR检测脂肪细胞标志物的表达。油红O染色1．9统计学处理按说明书进行：将细胞用清理液清洗后，加入固定液采用SPSS15．0统计软件，计量资料以均数±标 刘虹麟，等．单细胞克隆肝癌干细胞向间充质样细胞的分化潜能原因之一。对肿瘤干细胞特性的深入研究有助于开和研究已成为非常重要的手段。因此，为分析肿瘤发清除肿瘤干细胞的治疗手段，本研究对肝癌干细干细胞的分化特性，首先对从肝癌组织中分离获得胞向间充质细胞分化的特性进行了分析。的肿瘤干细胞进行了单细胞克隆培养，以获得的单即使从同一组织来源的肿瘤干细胞也可能具有细胞克隆作为研究对象，确保了细胞的均质性，从而异质性’，以单细胞克隆方法进行干细胞分选排除了不同分化能力源自不同细胞的可能性。表3诱导前后的人LCSC表达间充质细胞的特异标志物Tab．3Expressionofmesenchymalcell-specificmarkersbeforeandafterinducementofLCSCsDataarerepresentedin“ACt／2一”’form对所获得的单细胞克隆的肝癌干细胞进行鉴定成骨、软骨及脂肪的不同表型细胞的可能。发现，该细胞表达多种经典的干细胞标志分子，如单细胞来源的LCSC具有多向分化潜能一方面CD133、CD34、Nestin、ABCG2、SCF和C-kit。前期研解释了肝癌异质性的可能原因，另一方面对开发靶究表明，该细胞也表达多潜能相关的因子，包括向LCSC的临床治疗提供线索。临床上很多肝癌在Oct4、S0x2、Nanog、C．myc、Lin28和Klf4，提示LCSC发现时已是晚期，无法进行手术治疗，因此保守治疗具有多向分化潜能。在其他研究中也证实CSC表是肝癌治疗的重要手段，减少和杀灭肝癌干细胞将达多种多向分化潜能因子。J，在表观遗传的调控对治疗效果非常重要。近年在其他类型肿瘤上的实下具有分化的可塑性，多向分化潜能是CSC的重要验研究发现，促进肿瘤干细胞的分化，提高其分化成特性之一。除内在因素外，微环境在决定干细胞行熟度可使其对化疗更敏感，明显改善疗效。本研为，尤其是干细胞分化方向上起着关键的作用。最究结果提示，肝癌干细胞也具有很强的分化潜能，对近研究表明，胚胎干细胞微环境可改变恶性肿瘤调控肝癌干细胞分化的关键因子和促进其分化的微细胞的表型特征，导致致瘤性降低。同样，肿瘤微环环境因素进行深入研究，将为开发以促进肝癌干细境也能使正常干细胞向恶性细胞发生转变。而胞分化、达到改善抗肿瘤疗效目标的新型治疗策略且，在不同微环境中，干细胞的分化方向可能完全不提供重要依据。同。在前期研究¨刮已证实，该群细胞在不同肿瘤微[参考文献]环境的诱导下，具有向不同肿瘤细胞分化的潜能。本研究中，为分析LCSC是否具有向间充质样[1]RountreeCB，MishraL，WillenbfingH．Stemceilsinliverdisea-sesandcancer：Recentadvancesonthepathtonewtherapies细胞分化的潜能，使用成骨、软骨及脂肪细胞培养基[J]．Hepatolog，2012，55(1)：298-306．诱导LCSC分化。在诱导2周后，Real-timePCR已[2]HassanKA，WangL，KorkayaH，eta1．Notchpathwayactivity能检测到间充质细胞标志物的表达明显上调(结果identifiescellswithcancerstemcell—likepropertiesandcorrelates未显示)；诱导3周后，成骨、软骨及脂肪细胞特异withwomesurvivalinlungadenocarcinoma[J]．ClinCancerRes，标志物的mRNA上调更加明显。并且，特殊染色结2013，19(8)：1972—1980．果证实，诱导后的LCSC分别出现了成骨、软骨及脂[3]KobayashiS，Yamada·OkabeH，SuzukiM，eta1．LGR5-positivecoloncancerstemcellsinterconve~withdrug—resistantLGR5-neg·肪细胞特异性标志物染色阳性，说明LCSC分别向ativecellsandalecapableoftumorreconstitution[J]．Stem以上三个方向发生了分化。由于进行多向分化潜能Cells，2012，30(12)：2631—2644．研究的LCSC来自单细胞克隆，因此排除了这种多[4]WichaMS．Targetingself-renewal，anAchilles’heelofcancer向分化潜能是由于细胞群体中本身就存在能够产生stemcells[J]．NatMed，2014，20(1)：14—15． ·250·中国肿瘤生物治疗杂志，2014年6月，21(3)[5]WangX，LiuJ，WangZ，eta1．Periostincontributestotheacqui—[13]ColomboF，BaldanF，MazzucchelliS，eta1．Evidenceofdistinctsitionofmuhipotentstemcell—likepropertiesinhumanmammarytumour·-propagatingcellpopulationswithdifferentpropertiesinpri--epithelialcellsandbreastcancercells[J]．PLoSONE，2013，maryhumanhepatocellularcarcinoma[J]．PLoSONE，2011，68(8)：e72962．(6)：e21369．[6]VargheseS，WhippleR，MartinSS，eta1．Muhipotentcancer[14]LeisO，EguiaraA，Lopez—ArribillagaE，eta1．Sox2expressioninstemcelsderivedfromhumanmalignantperitonealmesotheliomabreasttumoursandactivationinbreastcancerstemcells『J]．promotetumorigenesis[J]．PLoSONE，2012，7(12)：e52825．Oncogene，2012，31(11)：1354—1365．[7]AzziS，BrunoS，Giron—MichelJ，eta1．Diferentiationtherapy：[15]MathieuJ，ZhangZ，ZhouW，eta1．HIFinduceshumanTargetinghumanrenalcancerstemcellswithinterleukin15[J]．embryonicstemcellmarkersincancercells[J]．CancerRes，JNatlCancerInst，2011，103(24)：1884-1898．2011，71(13)：4640-4652．[8]GuptaPB，OnderTY，JiangG，eta1．Identificationofselective[16]OkudaH，XingF，PandeyPR，eta1．miR-7suppressesbraininhibitomofcancerstemcellsbyhigh—throughputscreening[J]．metastasisofbreastcancerstem—likecellsbymodulatingKLF4Cell，2009，138(4)：645-659．[J]．CancerRes，2013，73(4)：1434．1444．[9]MukhopadhyayP，Fan'ellT，SharmaG，eta1．Heterogeneityof[17]LengZ，TaoK，XiaQ，eta1．Kruppel—likefactor4actsasanfunctionalpropertiesofclone66murinebreastcancercellsoneogeneincoloncancerstemcell—enrichedspheroidcells[J]．expressingvariousstemcellphenotypes[J]．PLoSONE，2013，8PLoSONE，2013，8(2)：e56082．(11)：e78725．[18]PostovitLM，MargaryanNV，SefiorEA，eta1．Humanembryonic[1O]IjuH，ZhangW，JiaY，eta1．Single—cellclonesoflivercancerstemcellmicroenvironmentsuppressesthetumorigenicphenotypeofstemcellshavethepotentialofdiferentiatingintodifferenttypesofaggressivecancercells[J]．ProcNatlAcadSciUSA，2008，105tumorcells[J／OL]．CellDeathDis，2013，4：e857．(11)：4329-4334．[11]DriessensG，BeckB，CaauweA，eta1．Definingthemodeof[19]ChenL，KasaiT，LiY，eta1．Amodelofcancerstemcellstumourgrowthbyclonalanalysis[J]．Nature，2012，488(7412)：derivedfrommouseinducedpluripotentstemcells[J]．PLoS527-530．ONE，2012，7(4)：e33544．[12]VermeulenL，TodaroM，deSousaMelloF，eta1．Single—cellcloningofcoloncancerstemcellsrevealsamulti-·lineagediferenti--[收稿日期]2014—02—14[修回日期]2014—04—05ationcapacity[J]．ProcNailAcadSciUSA，2008，105(36)：[本文编辑]周玲琳，韩丹13427．】3432．·科技动态·转染因子BATF在CD8T细胞分化过程中起决定性作用既往对CD8T细胞分化过程中的转录调控研究表明，多种转录因子如T—bet、Eomes、Runx3、Id2、Blimp一1等，在CD8T细胞增殖活化以及发挥效应功能中起着重要的作用，但如果单独敲除上述任一转录因子，CD8T细胞的增殖和活化仅受极小影响，说明上述因子在功能方面可能存在重叠性，而且在这些转录因子的上游可能存在一个更为重要的转录因子。本文报道的研究围绕BATF展开。既往研究表明BATF在CD4T细胞，B细胞及巨噬细胞分化发育过程中起着关键的作用。该研究首先发现LCMV感染后在BATF一鼠中效应及记忆性T细胞明显减少，说明BATF在CD8T细胞从Nai've到effector和memory的分化过程中起着关键的作用，在此后的过继回输实验中又证实BATFI／一鼠中效应以及记忆T细胞的缺失是内在性的缺陷，而非T细胞分化发育的环境因素引起。如在BATF一鼠中CD8T细胞中过表达BATF可以挽救BATFI／一鼠CD8T细胞分化发育的缺陷，表现为LCMV感染后BATF一鼠中CD8T细胞向效应以及记忆T细胞分化恢复正常。此后的Chip—seq实验证明，在CD8T细胞中，BATF多结合在效应分子序列的promoter以及enhancer区，并不结合于效应分子的调控序列区或poly‘comb区，并多与IRF-4和Jun形成复合物。BATF靶向的效应分子分布广泛，包括大量转录因子、T细胞活化相关分子、细胞因子信号通路各种分子、凋亡过程中各分子、细胞迁移相关分子、CD8T细胞的效应分子以及代谢过程中各类分子，侧向证明了BATF在CD8T细胞从NaYve到efector和memory分化过程中的决定性作用。[田军摘译，郭振红审阅．KurachiM，BarnitzRA，YosefN，eta1．NatImmunol，2014，15(4)：373-383．]