O型口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建及其鉴定.pdf

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1、第36卷第8期中国预防兽医学报Vo1．36．No．82014年8月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineAug．2014doi：10．3969~．issn．1008—0589．2014．08．07O型口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建及其鉴定孙超，杨德成，高荣远，周国辉，王海伟，于力(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／牛羊传染病研究创新团队，黑龙江哈尔滨150001)摘要：为构建含有海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的O型口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子，本研究在前期构建的0

2、型FMDVcDNA感染性克隆的基础上，利用融合PCR的方法，以Rluc报告基因替换FMDV的前导蛋白Lb基因和结构蛋白P1基因，构建含有Rluc报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDVRep。将该复制子质粒线性化后，经体外转录制备复制子全长RNA，转染BHK．21细胞，通过RT．PCR方法和间接免疫荧光试验分别检测该复制子RNA的自主复制能力以及FMDV非结构蛋白3B的表达情况。结果显示，复制子RNA在BHK．21细胞中能够进行自主复制并且能够表达病毒的非结构蛋白。Rluc活性检测结果表明，该复制子RNA在BHK-21细胞中可以高效表达Rluc，

3、在转染后2h～12hRluc活性呈线性递增，进一步反映该复制子具有良好的表达外源基因的能力。0型FMDV亚基因组复制子的构建，为深入研究FMDV的复制和翻译机制奠定了基础。关键词：O型口蹄疫病毒；海肾萤光素酶；复制子中图分类号：$852．65文献标识码：A文章编号：1008—0589(2014)08—0611-04Constructionofsub—genomicrepliconof0serotypefoot--and--mouthdiseasevirusSUNChao，YANGDe—cheng，GAORong-yuan，ZHOUGuo-hui，

4、WANGHai—wei，YULi’(DivisionofLivestockInfectiousDiseases，StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，Ha~inVeterinaryResearchInstituteChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China)Abstract：Toconstructsub·-genomicrepliconofOserotypefoot-and·-mouthdiseasevirus(FMDV)usin

5、grenillaluciferase(Rluc)asthereportergene，theLbandP1geneinafull—lengthcDNAcloneofOserotypeFMDVwasreplacedwiththeRlucreportergenebyfusionPCR．Thenthetranscfi~'tedRNAofrepliconwaspreparedfromthelinearizedrepliconinvitroandtransfectedintoBHK—·21cellsinwhichthereplicationoftherepl

6、iconwithRlucgenewasdetectedbyRT--PCRandimmunofluorescenceassay，respectively．Theresultsshowedthattherepliconwasabletoself-replicateandexpressnonstructuralproteinofFMDVinBHK-21cells．Inaddition，theRlucsignalsincreasedexponentiallyduring2to12hourspost—transfection，whichproperlyre

7、presentedthereplicationandtranslationeficiencyofthereplicon．TheconstructionoftherepliconwouldfacilitatefurtherstudyoftheregulationmechanismsofFMDVforreplication．Keywords：0serotypeFMDV；renillaluciferase；replicon*Correspondingauthor收稿日期：2014．01．21基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(030201

8、3012)作者简介：孙超(1987一)，女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事动物疫苗及动物传染病研究通信作者：E—mail：yuli