蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析

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1、双向电泳操作经验及解析目录1蛋白质组研究概述2双向电泳样品制备3双向电泳操作解析4荧光差异双向电泳5染色及差异分析目录1蛋白质组研究概述2双向电泳样品制备3双向电泳操作解析4荧光差异双向电泳5染色及差异分析蛋白质组学研究必要性¾生物调控机制的复杂性：涉及多个基因的多个层次的系统调节¾蛋白质：基因功能的执行者，调控更为直接¾蛋白质组学：从全局和整体的角度发现去解决问题，分析更为全面¾蛋白质组学与代谢组学等其它策略相结合：发展的新趋势FromDNAtoProteinFromProteintoMetabolite蛋白质组学研究现状数据库：NCBI-PUBMED时间：

2、2011年9月5日条件：标题检索词汇：物种名+proteome蛋白质组学主要研究方向¾表达蛋白质组学：V人类肝脏蛋白质组计划V人类血浆蛋白质组计划¾比较蛋白质组学：V动物疾病的发病机制V植物抗逆的分子机理V生物标志物发掘¾蛋白质互作组学¾蛋白质翻译后修饰蛋白质组学研究常用技术双向凝胶电泳(2-DE)一级质谱(MS-PMF)凝胶荧光差异双向电泳(DIGE)串联质谱(MS/MS)二维色谱(2D-HPLC)非凝胶部分序列比对(SequenceQuery)毛细管电泳(HPCE)分离鉴定计算机辅助（PDquest、Mascot）蛋白质双向凝胶电泳¾优点：蛋白质组研究的经

3、典技术、分辨率高、可视性好¾缺点：重复性不高、对于极端等电点和极端分子量蛋白分离效果不好蛋白质双向凝胶电泳部分仪器设备等电聚焦仪SDS-PAGE电泳仪凝胶扫描仪蛋白质双向凝胶电泳常规双向电泳pH4712%SDS-PAGECBBStainSilverStain蛋白质双向凝胶电泳荧光差异双向电泳目录1蛋白质组研究概述2双向电泳样品制备3双向电泳操作解析4荧光差异双向电泳5染色及差异分析生物样品分类细菌亚细胞植物细胞真菌体液动物组织其它其它生物分类形态分类生物样品分类以动植物组织为例：特性动物组织植物组织细胞壁无有液泡无有蛋白含量高低次生代谢物低高¾细胞壁：增强细胞

4、坚韧程度，同时也增加细胞破碎难度¾液泡：含有多糖多酚类物质，干扰蛋白提取¾蛋白含量：需要的样本量与样本蛋白含量高低密切相关，同时蛋白含量较低的植物样品往往需要通过一些方法进行蛋白富集¾次生代谢物：植物组织次生代谢物质含量高，一方面降低蛋白含量、另外也可能干扰蛋白提取样品制备要求¾高溶解能力：尽可能提取出最大量的蛋白，减少蛋白损失¾去杂：多糖、DNA、蜡质、多酚、油脂¾高浓度：蛋白沉淀、冻干、超滤进行浓缩¾去高丰度蛋白：白蛋白、IgG、Rubisco¾避免蛋白损失和人为修饰：减少操作步骤、含尿素溶液温度不要超过37度¾避免降解：减少操作步骤、低温操作、添加蛋白酶

5、抑制剂样品破碎方法¾机械方法：V液氮研磨：细菌、动植物组织V高速匀浆：细菌、动植物组织¾物理方法：V超声处理：细菌、脑组织匀浆、培养的动物细胞V反复冻融：培养的动物细胞V冷热交替：培养的动物细胞¾化学方法：V裂解液裂解：培养的动物细胞V酶溶解：细菌、酵母常用制备方法直接裂解法：V优点：操作简单，速度快、蛋白得率高V缺点：杂质多V适用样品：动物组织或细胞TCA/丙酮沉淀法：V优点：蛋白纯度高V缺点：操作繁琐、速度慢，蛋白损失多V适用样品：植物组织、体液、胞外分泌蛋白常用制备方法超滤法：V优点：操作简单，速度快V缺点：费用贵V适用样品：胞外分泌蛋白、体液、尿液其它

6、方法：V硫酸铵沉淀法V酚抽提法V酒精提取法V……蛋白裂解液配置蛋白裂解液成分：¾变性剂：尿素、硫脲¾去污剂：两性去污剂(CHAPS)、非离子去污剂(NP-40、Triton-100)、阴离子去污剂(SDS)¾还原剂：DTT、DTE、TBP、2-巯基乙醇¾增溶剂：两性电解质、Tris碱常用裂解液：¾Tris裂解液：40mMTris(pH=9.5)¾尿素裂解液：9M尿素、4%CHAPS、1%DTT、1%CA¾尿素硫脲裂解液：7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、1%DTT、1%CA常用样品保存方法及保存时间特性4度保存于冷冻保存于-冻干成蛋白蛋白溶液20度、-80度

7、干粉后冷冻或液氮条件保存保存时间1个月数年数年反复使用次数多次一次一次蛋白提取常见问题实例症状：靠近酸性端形成纵向分割，形成“半面妆”可能原因：硫脲使烷基化不完全改进：裂解液中不添加硫脲Buffer：7M尿素、2M硫脲、Buffer：9M尿素、4%CHAPS、4%CHAPS、1%DTT、1%IPGbuffer1%DTT、1%IPGbuffer蛋白提取常见问题实例症状：蛋白点数目差异较大可能原因：不同裂解液蛋白裂解能力不同改进：选用裂解能力强的裂解液¾LysisA(1826spots)：8M尿素、2%CHAPS、20mMDTT、0.5%CA(pH=4-6.5)¾

8、LysisB(1337spots)：7