双向凝胶电泳

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1、目录第一章样品制备21.1一般性原则21.2样品制备程序31.2.1培养细胞样品处理方法31.2.2组织样品处理方法31.2.3文献报道较多的裂解液配方4第二章第一向等电聚焦（IEF）72.1IPG胶条的水化和电泳72.1.1仪器72.1.2试剂72.1.3实验步骤72.2IPG胶条的平衡92.2.1仪器102.2.2试剂102.2.3实验步骤10第三章第二向SDS电泳123.1垂直SDS-PAGE123.1.1溶液123.1.2灌胶步骤123.1.3电泳步骤14第四章2-DE胶蛋白质点的检测154

2、.1考马斯亮兰染色154.1.1经典的考马斯亮兰染色程序154.1.2Neuhoff胶体考染法154.1.3热考马斯亮兰染色及二次染色法164.2硝酸银染色16AppendixITroubleshooting18AppendixIISolutions232DE分析流程：样品制备（Samplepreparation）固相pH梯度胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）第一向胶条的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS电泳（SDS-PAGE）检

3、测染色（Detection/Staining）1第一章样品制备（SamplePreparation）1.1一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotr

4、opes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX-100等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducingagents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA、PMSForProteaseinhibitorcocktai

5、ls）以及核酸酶。样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条；这样都会造成2-DE的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2

6、D胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。21.2样品制备程序：1.2.1培养细胞（culturecell）样品处理方法：培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysisbuffer）抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：(A)7MUrea，2MThiourea，4％（w/

7、v）CHAPS，40mMTris-Base，40mMDTT，2％PharmalytepH3-10.其他常用的裂解缓冲液如下：(B)9.5Murea,2%(w/v)CHAPS,0.8%(w/v)PhamarlytepH3-10,1%(w/v)DTTand5mMPefablocproteinaseinhibitor;o(C)加入0.3-1%SDS在95C煮样品5mins，冷却后加入至少5倍体积的（A）或（B）裂解液。总蛋白抽提程序：（1）培养细胞的收集；（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3次（室温，10

8、00g，各2min）；（3）将细胞分装到1.5mlEppendof管中，吸干残留的PBS；6（4）加入裂解缓冲液（1.5x10个细胞大约加入100µL裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；o（5）4C，40,000g，离心1h；（6）吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里o保存在-78C备用。1.2.2组织样品处理方法：对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总