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1、第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE)蛋白质组分析的技术路线双向凝胶电泳技术的发展及原理仪器简介样品制备技术流程1.蛋白质组分析的技术路线要求流程技术路线蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得蛋白质组分析流程蛋白质组
2、研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定2.双向电泳技术的发展及原理双向凝胶电泳的发展双向凝胶电泳的基本原理双向凝胶电泳的发展双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies和Poulik提出(SmithiesO,PoulikMD.Two-dimensionalelectrophoresisofserumproteins.Nature,1956,177:1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移
3、率(free-solutionmobility)，在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳(RaymondS,WeintraubL.Acrylamidegelasasupportingmediumforzoneelectrophoresis.Science,1959,30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶(MargolisJ,KenrickKG.Two-dimensionalresolutionofplasmaproteinsbycombinatio
4、nofpolyac-rylamidediscandgradientgelelectrophoresis.Nature,1969,221:1056-1057)，这即是双向凝胶电泳(two-dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis,2DPAGE)。同年，2DPAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE(DaleG,LatnerAL.Isoelectricfocusingofserumproteinsinacrylamidegelsf
5、ollowedbyelectrophoresis.ClinChimActa,1969,24:61-68；MackoV,StegemannH.Mappingofpotatoproteinsbycombinedelctrofocusingandelectrophoresisidentificationofvarieties.Hoppe-seyler’sZPhysiol.Chem,1969,350:917-919)。20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠(SDS)(BarrettT,GouldHJ.Tissueands
6、peciesspecificityofnon-histonechromatinproteins.BiochimBiophysActa,1973,294:165-170；MartiniOHW,GouldH.J.Enumerationofrabbitreticulocyteribosomalproteins.JMolBiol,1971,62:403-405；StegemannH.proteinfraktionierungeninpolyacrylamidunddieanwendungaufdiegenetischeanalysebei
7、pflanzen.AngewChem,1970,82:640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDSPAGE。1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳(O’FarrellPH.Highresolutiontwo-dimensionalelectrophoresisofproteins.JBiolChem,1975,250:4007-4021；KloseJ.proteinmappingbyc
8、ombinedisoelectricfocusingandelectrophoresisofmousetissues.Anovelapproachtotestingforinducedpointmutationsinmammals.Humangen
