几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较

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1、几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较作者：秦慧，刘霆，柳斌，宋鑫，黄欣，杨金亮，赵霞，魏于全【摘要】本研究对蛋白质染色法进行比较和分析，以求获得满足蛋白质组研究所需的适宜的蛋白质检测法。实验采用2-D电泳分离急性早幼粒白血病细胞株NB4的全蛋白及1-D电泳分离蛋白质分子量标准物，从蛋白质检测的灵敏性、质谱兼容性、操作的简便性等角度，比较了传统考马斯亮蓝染色法、胶体考马斯亮蓝染色法、改良考马斯亮蓝染色法和银染法4种蛋白质着色法对凝胶分离蛋白质的检测影响，探讨了影响蛋白质染色与鉴定的影响因素。结果显示，银染检测灵敏度最高，但质谱鉴定相容性差，鉴定率近10

2、%；改良考马斯亮蓝染色法检测灵敏度也高，可达4ng/spot，质谱鉴定率可接近55%。结论：改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质检测灵敏度高，与质谱兼容好，能满足蛋白质组研究需要。【关键词】蛋白质组　　AbstractTheaimofthisstudyalstainingmethodforproteomicresearch.ProtEInsfromacutepromyelocyticleukemiacelllineNB4andproteinmoleculararkerassiebrilliantblue，thecolloidalCoomassiebrilli

3、antblue，themodifiedCoomassiebrilliantblueandthesilverstainingprotocols.Theproteindetectionsensitivity，patibilityassspectrometry(MS)andfacilityofthefourstainingprotocolsodifiedCoomassiebrilliantbluestainingassiebrilliantbluestainings，closetobutloodifiedCoomassiebrilliantbluestai

4、ningishigh，anditspatibilityodifiedCoomassiebrilliantbluestainingisanoptimalstainingmethodforproteomicresearch.　　Keyics；tensionalgelelectrophoresis；proteindetection；Coomassiebrilliantbluestaining；silverstaining　　蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质

5、谱鉴定。选择适当的蛋白质染色法将有助于提高蛋白质组学研究结果的质量。蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasiebrilliantblue，CBB）为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差；银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容；荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用；而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题［1-4］。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋

6、白质组研究所需。由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一［5-7］。我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色　　法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。　　材料和方法　　试剂　　固相pH梯度干胶条（IPGstrippH3-10NL，IPGstrippH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte3/10Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。硫酸铵

7、及磷酸均购自成都科龙试剂厂。AgNO3为Sigma公司出品。Proteinmoleculararker#SBI公司出品。甲醛、Na2S2O3与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。　　仪器　　IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Poeter扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。　　细胞总蛋白质的提取　　取4份经常规培养的急性早幼粒白血病细胞株（NB4）1×107细胞各重悬于350μl蛋白质裂解缓冲液中（8mol/LUrea，2g/LCHAPS，2mmol

8、/LTBP，2ml/LCarrierAmpholyte，痕量溴酚兰），置冰浴中超声裂解，静置30分钟，155