蛋白质含量测定几种方法的比较

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1、蛋白质含量测定几种方法的比较罗锦钟（浏阳三中湖南浏阳410301）摘要：以菠菜叶片为材料，用磷酸缓冲液提取该植物总蛋白，分别用UV，Bradford,双缩脲法测量其含量，并进行比较；同时分别以磷酸缓冲液，双蒸水，0.15mol/lNaCl溶液，裂解液为介质提取其总蛋白，用Bradford法测量它们的蛋白含量。结果表明磷酸缓冲液提取蛋白质用UV，Bradford,双缩脲法测定，由于各种方法都有不同的干扰因素，不同的灵敏度等原因，造成了测量结果不相同；分别用磷酸缓冲液，双蒸水，0.15mol/lNaCl溶液，裂解液方法提取的总蛋白，均用Bradford法测量蛋白

2、含量，结果是裂解液提取的蛋白液为最大，仅次为磷酸缓冲液，0.15mol/lNaCl溶液提取的，双蒸水提取的蛋白含量最少，比较各种提取液提取蛋白质的效果。最后对蛋白提取方法和测定方法进行较为详细的讨论。关键字：蛋白质；测定；AbstractKeywords:protein;determination蛋白质在食物中最为重要的营养的物质之一。蛋白质提取与含量测定是食品检验工作的一项重要内容。蛋白质的提取可以通过不同方法进行，可以根据蛋白质的下列性质来分：（1）分子大小；（2）溶解度；（3）电荷；（4）吸附性质；（5）对配体分子的生物学亲和力等。而根据溶解度的不同来

3、提取是在实践中最常用的方法，不同的溶剂，不同的外部因素（包括PH值、离子强度、介质常数、温度）都会造成对蛋白质的溶解与提取。有机溶剂分离法很常用，与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀，质溶解度等差异所以不同的提取液会造成提取蛋白量的数量不同。蛋白质含量测定方法根据其原理分两类：一类是利用蛋白质的物理化学性质如折射率，比重，紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量如微量凯氏定氮法，双缩脲反应，Folin-酚试剂法（lowry法）[1]。凯氏定氮法能够准确的测定蛋白质

4、的含量。用浓硫酸消化是天然的含氮有机化合物分解出氨，氨与硫酸化合生成硫酸氨。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液使硫酸氨分解放出氨。用水蒸气蒸馏法将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定，准确测定氨量。从而计算氮量。但常规的或改良凯氏定氮法费时费电费水且操作繁琐，试剂消耗量大而且先进的蛋白质测定仪价格昂贵也需要专门的试剂目前尚难普及[2]。Folin-酚测定法实验室使用较多，此法操作简单迅速不需特殊的仪器设备灵敏度高，15分钟就有最大的显色并可稳定几小时。不足之处是受多种因素的干扰如以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及

5、蔗糖，硫酸铵，巯基化物均可烦扰Folin-酚反应。此外所测的蛋白质样品中如含有酚类及柠檬酸，均对次反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），磷酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时则需做校正曲线。如所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠-氢氧化钠浓度即可显色测定。如样品酸度较高，也需提高碳酸钠-氢氧化钠的浓度1-2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病[1]。为了更好认识用磷酸缓冲液，双蒸水。0.15mol/lNaCl溶液，裂解液作为提

6、取液提取蛋白的差异做了以下实验。而作为常用方法的双缩脲法紫外（UV）吸收法，考马斯亮蓝法我做了实验来充分的认识它们。一、材料和器材（一）试剂9CuSO4.5H2O，浓氨水，NaOH，考马斯亮蓝G-250，NaHPO4.H2O，Na2HPO4.12H2O，95%乙醇中,85%磷酸，KCl,甘油，脲，硫脲，SDS，Tris，TritonX-100(m/v)，丙酮，石英砂，牛血清蛋白，NaCl以上药品均为化学纯，试剂均用由实验室自行配制的双蒸水配置。（二）器材可见光分光光度计（仪器VIS-7220），托盘电子分析天平（岛津AY120），快速混合旋涡器SK-1，Pr

7、olinepipetle移液枪（20-200µl,100-1000µl）,全自动高速冷冻离心机(湘仪GL20A)离心管(1ml,10ml,25ml.),玻璃棒漏斗研钵等二、步骤及方法（一）蛋白质的提取1．材料处理从新鲜的菠菜中挑选幼嫩的叶片，通过去主叶脉，并将叶撕成小片，称的质量为62g,将叶平均分为4份，每份为15.5g。分别放入4个研钵编号ABCD，在每一研钵中分别加入少许石英砂，进行研磨。在ABCD中分别加入20ml的磷酸缓冲液（称取1.1120g硫酸二氢钠（NaHPO4.H2O）和4.6605g磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）分别稀释到40m

8、l,65ml标明AB液取A液39mlB液61ml混合