2.2 基因工程载体-噬菌体载体 201209

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1、2012.09第二节噬菌体载体2噬菌体载体（phagevectors）一、噬菌体载体二、单链噬菌体载体三、噬菌粒载体四、柯斯质粒载体一、噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）（一）噬菌体的一般特性结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。T4Bacteriophage71.噬菌体的生物学特性溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细

2、胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。噬菌体温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期分为两种：（1）溶菌周期：噬菌体的生活周期烈性噬菌体（virulentphage)（2）溶原周期：感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化温和噬菌体（temperatephage)2、噬菌体的结构和其核酸类型：结构：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面

3、体型、线状体型核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。3、λ-DNA的物理图谱λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。λ噬菌体组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长溶菌性生长（

4、lyticpathway）噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长(lysogenicpathway)噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。噬菌体AWBDEFZJattxisNclcroOPQSR结构区重组区调控区裂解区cos位点cos位点ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置换型AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

5、cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS头部基因尾部基因功能不明区溶源化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必须区段cI基因：溶源过程控制基因。λ噬菌体的基因组结构5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularfo

6、rmLinearform（二）λ噬菌体载体的主要类型（1）插入式载体一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体。（2）替换型载体（取代型载体）具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。（3）凯伦噬菌体载体（2）λ替换型载体（取代型载体）外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段(~20kb)高感染效率(109转化株/ug载体DNA,比质粒高100-倍)e.g.EMBL3,DASH替换式载体野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DN

7、A可以取代这一片段，例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的LacZ）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。（3）凯伦噬菌体载体既有插入型；又有替换型在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源DNA的能力：几个kb到23kb（左右臂连接）（三段自身连接）（

8、插入片段）（三）体外包装λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106~108/μgDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103~105/μgDNA。