噬菌体载体和柯斯载体

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1、第五章噬菌体载体和柯斯载体本章主要内容噬菌体一般特性λ噬菌体柯斯质粒M13噬菌体1、M13噬菌体特性及基因组结构2、M13噬菌体载体类型及特点噬菌粒比较第一节噬菌体的一般生物学特性（Bacteriophage，phage）噬菌体可以在脱离寄主细胞的状态下保持生命，但一旦脱离了寄主细胞，就不能生长和复制利用寄主的核糖体、蛋白质合成因子、氨基酸和产能体系，进行生长和繁殖可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏；2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体

2、的体系，从而生长出大量的子代噬菌体颗粒；4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒一、噬菌体的结构和其核酸类型结构：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、线状体型核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂；对寄主的依赖性较低有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的A/T/C/G组成的。Example：T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）；SP01噬菌体DNA中没有T碱基，取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。二、噬菌体的感

3、染性噬菌斑形成噬菌体感染高浓度细菌在未发生第一次裂解前涂布平板噬菌体的感染过程尾部粘至细胞壁尾部蛋白质收缩核酸注入细菌利用细菌的RNA聚合酶和核糖体翻译得到噬菌体蛋白使细菌的DNA降解合成自身的DNA至数百个拷贝合成头部尾部蛋白进行组装三、噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1、吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞3、转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所4、合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质5、组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗

4、粒6、释放子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来四、噬菌体的溶源生命周期溶源生长周期：是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期1、概念温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期。溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体DNA中原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。2、溶源周期的

5、主要特征λ噬菌体和P1噬菌体λ噬菌体的特征：(1)噬菌体的DNA分子注入细菌细胞(2)经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭(3)噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体(4)细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。噬菌体P1基本特征：不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。3、超感染免疫性（1）溶源细菌的两个重要特点：不能被头一次感染的噬菌体再次感染，称为超感染免疫性；经过许多世代以后，溶源性细菌可以进入溶菌周期，称为溶源性诱发。①超敏感免疫性阻遏－操纵

6、体系：cⅠ基因编码阻遏蛋白，启动子PL和PR，操纵基因OL和OROLPLcⅠPROR阻遏蛋白同操纵基因结合使RNA聚合酶不能起始转录，这种状态有充分的能力使原噬菌体保持“关闭”形式，溶源细菌能够正常生长。②溶源噬菌体的诱发依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌体转录。需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染色体上删除下来，使之形成环形的DNA分子，恢复溶源周期开始时的状态。整合酶必须首先与宿主编码的宿主整合因子(hostintegrationfactor，Hif)结合形成复合体，才能催化attP和attB在O区进行重组而形成原噬菌体。Hif五、重组噬

7、菌体的分离大肠杆菌培养至对数生长期•加入λ噬菌体悬浮液，37℃培养1小时•用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时•高速离心，沉淀噬菌体•苯酚抽提，释放λ-DNA•乙醇或异丙醇沉淀DNA。back1、λ噬菌体特性及基因组结构2、λ噬菌体载体类型及特点第二节λ噬菌体载体backλ噬菌体分子量31×106dal，中等大小的温和噬菌体，目前已经定位61个基因，其中一半参与了生命周期，为必要基因；余下的为非必要基因。溶菌阶段(复制和释放)溶源阶段(整合寄主染色体)λphage一、