shRNA干扰大肠癌组织STAT3基因表达对顺铂化疗敏感性的影响-论文.pdf

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1、山东医药2013年第53卷第41期shRNA干扰大肠癌组织STAT3基因表达对顺铂化疗敏感性的影响秦安成，黄海，高源，乔志明，钱伟峰(南京医科大学附属苏州医院，江苏苏州215002)摘要：目的观察shRNA干扰大肠癌组织信号转导子与转录活化子3(STAT3)基因表达对顺铂(DDP)化疗敏感性的影响。方法利用RNA干扰技术获得HT一29一shSTAT3细胞株(STAT3低表达的大肠癌HT一29细胞)、阴性对照HT-29一GFP细胞。MTF法检测大肠癌HT-29、HT-29-GFP、HT-29-shSTAT3细胞对DDP的敏感

2、性，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果大肠癌HT-29、HT-29一GFP、HT-29一shsTAr乃细胞经10g／mLDDP作用48h后，细胞抑制率分别为(38．5±9．1)％、(39．3±5．7)％和(73．0±7．2)％，3组细胞凋亡率分别为(22．3±6．1)％、(26．0±3．5)％和(43．34-5．1)％。HT一29一shSTAT3细胞明显高于HT-29细胞、HT一29-GFP细胞(P均<0．01)。结论STAT3通路可提高大肠癌HT-29细胞对DDP的敏感性；促进细胞凋亡可能是产生化疗增敏效应的机制。关键词：肠

3、肿瘤；信号转导子与转录活化子3；RNA干扰；顺铂；敏感性，化疗doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2013．41．020中图分类号：R735．3文献标志码：B文章编号：1002-266X(2013)41-0056-03信号转导子与转录活化子3(STAT3)是信号转RNA提取试剂盒购自Qiagen公司，实时定量PCR仪购导与转录活化蛋白(STAT)家族的重要成员。在正自美国ABI公司，流式细胞仪购自美国BectonDiekin．常组织细胞中，STAT3的表达非常短暂，但在多种恶son公司。DDP购于南京

4、制药厂。性肿瘤细胞中表现为高表达和持续性激活，且肿瘤1．2方法的恶性程度及预后与其高表达密切相关。Jia1．2．1慢病毒的包装、生产及感染大肠癌HT．29细等研究发现，STAT3的表达可以调控Bcl-XL、胞并筛选稳转细胞株慢病毒包装质粒混合物、Bcl-2、C．myc、CyclinD1、VEGF等基因的表达，继而pRNAT—shSTAT3共转染293T细胞；转染12h后换诱导肿瘤细胞增殖、阻断细胞凋亡等。因此，STAT3含10％胎牛血清的DMEM培养液；培养48h后收基因被认为是一种重要的癌基因。Wen等研集病毒上清，40

5、00r／min离心10min，0．45Ixm究发现，肿瘤组织中STAT3的异常激活与可介导肿PVDF膜过滤上清，病毒液一80cC冻存。病毒液经瘤细胞对化疗药物耐药有关。为此，2012年7月～系列稀释后感染293T细胞，感染24h经荧光显微2013年3月，我们利用RNA干扰技术、通过慢病毒镜下观察。接种生长状态良好的HT-29细胞至24介导shRNA抑制大肠癌HT-29细胞(STAT3高表孔板，用含10％胎牛血清的1640培养基，37℃和达)STAT3基因的表达后，观察了肿瘤细胞对顺铂5％CO：培养过夜，以感染复数为10的病

6、毒液感染(DDP)的敏感性变化。现报告如下。细胞，每孔加入多季胺，使其终浓度为8mL。121材料与方法h后换液，96h后用0418(浓度为500g／mL)筛1．1材料慢病毒包装细胞293T及大肠癌HT-29细选，192h后筛选出阳性克隆，以后将G418的用量胞，购自中科院细胞研究所；慢病毒载体系统，由质粒减少到300g／mL，筛选出的阳性细胞克隆传代后pRNAT—U6．2／nti和Packagingsystem组成，购自逐步扩大培养，细胞株命名为HT-29一shSTAT3细胞。Genseript公司；慢病毒干扰质粒pRNA

7、T—shSTAT3由笔同法用慢病毒空质粒pRNAT-U6．2／Lenti和慢病毒者研究团队前期构建_1。兔抗人STAT3抗体、GAPDH包装质粒混合物共转染293T细胞，获得慢病毒感染抗体购自SantCruz公司，LipofeetamineTM2000购自In—大肠癌HT-29细胞并筛选稳转细胞株命名为HT一vitrogen公司，多季胺、G418购自Roach公司，Annexin29一GFP细胞。细胞株经反复冻存，观察其荧光表达V．FITC和20PI购自美国MolecularProbes公司，是否稳定。1．2．2shRNA

8、对STAT3基因的沉默效率按试剂通信作者：钱伟峰说明书完成大肠癌HT-29细胞、HT．29-GFP细胞、HT—56山东医药2013年第53卷第41期29一shSTAT3细胞RNA的提取，合成cDNA，以上述细0．01)，而大肠癌HT·29细胞、HT一29-GFP细胞胞的cDNA为模板，实时定量PCR(S