分泌型卷曲相关蛋白抑制实验性小鼠肝纤维化的研究-论文.pdf

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1、一272一现代消化及介入诊疗2014年第19卷第4期ModernDigestion&Intervention2014，Vo1．19，No．4·短篇论著·分泌型卷曲相关蛋白抑制实验性小鼠肝纤维化的研究毕婉蓉-邢海林杨长青。吴艳红金彩霞【摘要】目的探讨分泌型卷曲相关蛋白(secretedfrizzledSPF级健康SD雄性小鼠50只，体质(90±10)g。购自及relatedprotein，SFRP)对实验性小鼠肝纤维化(Hepaticfibro—饲养于同济大学动物实验中心。动物合格证号：SCXK(粤)sis

2、，HF)的抑制作用。方法建立小鼠cck诱导HF模型，随2004A084。动物房室温20—22℃，光照周期12h。实验前小机分为正常对照组、I-IF模型组与SFRP2shRNA处理组。小鼠适应环境1w，自由饮水。无不良反应，进食、饮水和活动鼠肝细胞中获得总RNA，经RT-PCR转化eDNA．构建正常者纳入实验。pcDNA1．0／SFRP2载体HF肝细胞并克隆获得pSilencer—二、肝纤维化诊断标准U6neo／SFRP2shRNA稳定转染肝细胞。采用Westernblot、免1．肝活检病理学检查疫荧光显微

3、镜及激光共聚焦定位分析观察SFRP2shRNA抑病理学检查是诊断HF的金标准。肝组织切片采用制HF作用。结果免疫双荧光显示SFRP2shRNA抑制HF小Massion染色，每张切片随机选取4个视野，用图象分析系统鼠肝细胞FSP一1mRNA、Smad2mRNA、Wnt3AmRNA的表测量胶原面积并自动计算与总面积的百分比，取平均数作为达：经RT-PCR及Westernblot分析支持SFRP2shRNA抑制判定HF程度的客观指标。由资深病理科医师阅片，按下列方HF小鼠肝细胞上皮一间质转换(Epithelia

4、l-mesenchymaltran—法进行HF分级。sitions，EMT)的发生(P<0．05)；流式细胞仪分析表明SFRP22．肝纤维化分级判定标准shRNA有缓解HF小鼠肝细胞凋亡的作用。结论我们研究证1级为正常肝组织．无纤维化：2级为某些门静脉区域有实SFRP在实验性小鼠肝上皮细胞中可能通过下调内源的某纤维延伸；3级为门静脉周围纤维化，并有短的纤维间隔伸入些自分泌信号抑制因子，抑制EMT程序，从而缓解HF。肝小叶，少数出现由门静脉延伸至邻近门静脉的纤维间隔，【关键词】肝纤维化；分泌型卷曲相关蛋白；

5、上皮一间质肝小叶结构欠完整：4级为大多数门静脉区域纤维间隔延伸’转换至邻近门静脉和肝的终末小静脉，肝lbDf结构变形，但是没有出现假小叶：5级弥漫性的假小叶形成。分泌型卷曲相关蛋白(secretedfrizzledrelatedprotein，三、试验试剂与仪器设备snu,)家族成员陆续在非洲爪蟾或其他个体如小鼠，人和鸡CC1(四氯化碳分析纯)(武汉化学试剂公司)；D．HankS等物种中被发现和分离出来，分别命名为SFRP1—5Ⅲ，也被定液(Gibco公司，美国)；链蛋白酶E，DNA酶I，TritonX一

6、100，义为凋亡相关基因(secretedapoptosis-relatedproteins，0．05％／5．3mM胰蛋白酶／EDTA消化液，无Ca2／MgPBS，SARPs)t2J。1997年首次克隆获得人的SARP1、SARP2、SARP3Nycodenze干粉，DMSO，MTT，FBS，血清替代物(KnockOut基因嘲。我国目前对上皮一间质转换(Epithelial—mesenchymalSerumReplacement，KOSR)．二甲基亚砜，NP一40，NonidetTMtransitions

7、，EMT)诱导慢性肝病纤维化(Hepaticfibrosis，HF)P一40，2mMGlutamax，20mMHEPES，SDS，110mMB一巯基发病机制进行了较多研究，但是否SFRP参与EMT，以及与乙醇，Trypsin—EDTA；胎牛血清，明胶(灏洋公司，天津)；鼠HF是否相关。国内外尚无报道，这将对于我们了解HF的发抗0【一SMA单克隆抗体．SABC试剂盒。DAB试剂盒(博士德生机制和开拓诊治思路具有重要意义。公司，武汉)；紫外分光光度计(岛津uV一2100，日本)；光学显微镜、倒置显微镜及荧光显

8、微镜(CH一2，日本)：MULTISKAN资料与方法MK3酶标仪，组织切片机(Thermo公司，德国)；硝酸纤维素一一、般资料膜电转移系统，蛋白垂直电泳转膜系统(BioRad公司，美国)；TanonGis一2010凝胶成像系统(Bio—RadDocGel2000，美DOI：10．3961／j．issn．1672—2159．2014．04．021国)；ImageJ图像分析软件(NCBI，美国)。作者单位：l200092同济大学附