Tgf2转座系统在转RFP基因斑马鱼上的应用-论文.pdf

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1、中国水产科学2014年7月，21(4)：647—654JournalofFisherySciencesofChina研究论文DoI：10．3724／SP．J．1118．2014．00647rgt2转座系统在转即基因斑马鱼上的应用吴芳一，叶星一，邹曙明2，张莉莉，孙成飞，田园园1，白俊杰，21．中国水产科学研究院珠江水产研究所；农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东广州510380；2．上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海201306摘要：提高目的基因的转植效率与可遗传效率是转基因鱼研制的关键点之一。本研究利用近年开发的金鱼转座子系统进行转

2、基因斑马鱼的研制，探讨其在转基因鱼上应用的可行性。通过PCR方法，改造，2转座子供体质粒pTgf2一EFla—eGFP,将肌球蛋白轻链2启动子(mylz2)与红色荧光蛋白基因(即)定向插人其中，构建可在肌肉组织特异性表达红色荧光蛋白的Tgt7转座子供体质粒pTgf2．Mylz2．RFP。通过显微注射，将rgt7转座子供体质粒与rgp转座酶mRNA共注射于斑马鱼(Danioririo)受精卵中，共注射受精卵972粒，出膜后存活的仔鱼803尾，其中携带外源基因的仔鱼为615尾，阳性率为76．6％。转红色荧光蛋白基因斑马鱼首代F。培育至性成熟，将其中的10尾F。斑马鱼分

3、别与野生型斑马鱼进行配对繁殖，其中1个组合产生了体表呈现均匀红色荧光的F1个体，因此RFP在F。的整合率为10％。将红色荧光F1个体培育至性成熟并与野生型鱼配对繁殖，F的阳性个体占69％。本研究结果说明，由rgt7转座子介导的转基因技术，可有效提高目的基因的转植效率与整合效率，在转基因鱼构建以及相关研究中具有开发应用前景。关键词：转座子；斑马鱼；转基因；红色荧光蛋白；整合率中图分类号：$962．1文献标志码：A文章编号：1005—8737一(2014)04~0647—08转座子(Transposon，Tn)是存在于染色体DNA进化过程中失活。Ivies等]通过基因

4、工程技术将上可自主复制和位移的单位，分为插人序列和复无天然转座活性的大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)合型转座子[¨。2O世纪4O年代美国学者McCli—转座子改造成具转座活性的转座子SB(sleepingntock[21首先在玉米中发现了可自主移动的DNAbeauty)；l997年日本学者Kawakami[7]在白化青片段。后来发现转座子广泛存在于从原核细菌到(OryziaslatipP)中发现了第一个天然的具有活性真核高等动植物的细胞中，如细菌、酵母、果蝇的脊椎动物转座子，即To12转座子(transposable(Drosophilamelanog

5、aster)、金鱼草(CeratophyllumelementofOryziaslatipes2)；近年发现的具转座demersum)和拟南芥rabidopsisthaliana)等[3-5J。活性的鱼类转座子还有青鲻Toll转座子(tran—根据活性不同，转座子可分为自主性转座子和非sposableelementofOryziaslatipes1)t引、鲽—自主性转座子，前者自身可编码转座酶，而后者nectesplatessa)Passport转座子J以及金鱼(Car自身不能编码转座酶，只有在前者存在时才能发assiusauratus)Tgf2转座子(trans

6、posonofgoldfish生转座，如玉米的AC转座子为自主性转座子，而2)[1o]等，其中／gt7转座子是迄今发现的第二例有Ds为非自主性转座子L2J。自主转座活性的脊椎动物转座子，为鲤科鱼类上脊椎动物如鱼类中也存在转座子，但大多在发现的唯一具有天然自主转座活性的转座元件。收稿日期：2013．09．17；修订日期：2013．12-09．基金项目：国家863计划项目(2011AA100404)；国家自然科学资金面上项目(31272688)．作者简介：吴芳(1988一)，女，硕士研究生，从事水产生物技术研究．E—mail：wfone0305@163．com通信作者

7、：叶星，研究员，博士生导师．E-mail：gzyexing@163．com第4期吴芳等：，2转座系统在转基因斑马鱼上的应用1．2肌肉特异性表达的转座子供体质粒注射针对1．2细胞期的斑马鱼受精卵进行显微注pTgf2一Mylz2一RFP的构建射。每个胚胎注射转座子供体质粒prgc?一Mylz2一对pTgf2一EF1—eGFP进行XhoI和ClaI双酶RFP与72转座酶mRNA混合液211L，质粒DNA切，酶切产物经1．2％琼脂糖凝胶，割胶并回收纯质量浓度为50n，mRNA的质量浓度为100I。化目的片段。为了将mylz2启动子和基因定对受精卵的动物极进行注射，注射完毕

8、后缓慢抽向