牦牛源多杀性巴氏杆菌LAMP检测技术的初步建立-论文.pdf

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1、安徽农业科学，JournalofAnhuiAgri．Sci．2013，41(34)：13126—13127，13129责任编辑陈娟责任校对况玲玲牦牛源多杀性巴氏杆菌LAMP检测技术的初步建立繁萍，张瑞强，杨月娟，艾军，周晓黎，钟兴芝(1，青海大学农牧学院，青海西宁810016；2．云南出入境检验检疫局，云南昆明650228)摘要参考已发表的多杀性巴氏杆菌KMT一1基因保守区设计LAMP引物，以牦牛多杀性巴氏杆菌PMqh一10株为对象，建立了用于检测牦牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增方法。结果显示，63℃水浴锅中反应50min即可观

2、察到阳性结果，dNTP的最适浓度是1．8mmol／L，Mg最适浓度是12mmol／L。方法特异性检测结果显示，该方法对随机选用的其他茵无扩增作用。关键词牦牛；多杀性巴氏杆菌；环介导等温扩增；KMT一1中图分类号$823．85文献标识码A文章编号0517—6611(2013)34—13126—02TheDevelopmentoftheLoopMediatedIsothermalAmplificationforDetectionofYakPasteurellamultocidaFANPingetai(AgricultureandAni

3、malHusbandryCollege，QinghaiUniversity，Xining，Qinghai810016)AbstractRefefredtopublishedPasteurellamultocida’sconservativeKMT一1gene．primersweredesignedfortheloopmediatedisothermaIamplificationfLAMP)todetectyakP∞tearellamultocidaPMqh一10．Theresultindicatedthatwithinfiftym

4、inutesundertheisothermalconditionsof63℃。positiveresultscanbeobserved，optimalconcentrationofdNTPiS1．8mmo1／L，andoptimalconcentrationofMgiS12mmo1／L．Themethodcantamplifvotherrandomselectedbacteria．KeywordsYak：Pasteurellamultocida：IJAMP；KMT一1多杀性巴氏杆菌是引起牦牛出血性败血症(Haemorrhag—在

5、温箱中37℃过夜培养，离心收集细菌，提取DNA(按照icceptieaemiaofcattle，HSC)的主要病原，病畜常见高热、肺DNA提取试剂盒说明书操作)，分装后，置于一20℃冰箱中炎间或呈现急性胃肠炎及内脏器官出血等特征性病变，多呈保存备用。散发或地方性流行，若不及时治疗死亡率极高，引起牦牛其他试验菌经液体LB培养基过夜培养，离心收集细菌，出血性败血症的病原主要为B型。以往青海地区的诊断技提取DNA，分装后一20℃保存备用。术主要依赖临床症状结合实验室细菌培养鉴定等作出判断，1．2．2引物。引物参考已发表的Pm种特异性基因

6、kmt．1诊断工作滞后，且准确性不高。国内外已建立了不同层次的(AY225341)，PCR鉴定引物premier5．0设计，序列：ALL1FPCR诊断技术，诊断的准确性与速度有了很大提高，但5’一ATCCGCTATITACCCAGTGG．3’、ALL1R5’．GCTGTA．对于青海省牧区而言，各层次的PCR诊断技术推广工作中，AACGAACTCGCCAC-3’，目的片段预期长度约460bp。在线存在地域性的不足，建立简便快速的诊断方法意义重大。PrimerExplorerV3设计LAMP引物。引物送invitrogen公司该试验把

7、LAMP技术。引人多杀性巴氏杆菌检测，以合成。期对牦牛出血性败血症的诊断建立简便快捷准确的途径。表1LAMP引物及配制方法1材料与方法名称序列工作液浓度1．1试验菌株与试剂C47—8标准菌株，购于中国兽医药品pmol／L监督所。PMqh一10株为该实验室分离鉴定保存菌株。其他供试菌株为云南出入境检验检疫局保存。细菌基因组DNA提取试剂盒购于上海捷瑞生物公司；琼脂糖购于上海基因有限公司；50bpMarker、6×Loadingbuffer、dNTP购于宝生物(大连)有限责任公司；BstDNAPol—ymerase、thermopol

8、buffer(含Mg2)购于Biolab公司；dsDNA1．2．3PCR鉴定。反应体系1：PremixTaq酶25l，包括稀reagent购自Invitrogen公司。释好的上游引物ALL1、下游引物ALL2各1l，模板1，无1．2试验方法菌水22