建立流式细胞术分析小巨核细胞方法的初步研究-论文.pdf

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1、世界最新医学信息文摘2014年第14卷第1期23·论著·建立流式细胞术分析小巨核细胞方法的初步研究宋燕华(郑州市骨科医院，河南郑州450000)摘要：目的建立流式细胞术(FCM)分析骨髓巨核细胞DNA倍体的方法，为小巨核细胞的检测提供更可靠的实验依据。方法对42例MDS患者进行骨髓巨核细胞绝对计数并在显微镜下对巨核细胞阶段进行分类；采用Percoll密度梯度分离液分离富集骨髓巨核细胞，用异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体标记巨核细胞糖蛋白IIb／IIIa(CD41a)，用PI标记巨核细胞DNA，利用流式细胞仪分析巨核细胞倍体并进行统计学分析。结果建立了基于CD4

2、1a和PI双标记的流式细胞术鉴别分析小巨核细胞的方法。结论CD41a和PI双标记的流式细胞术检测小巨核细胞的方法比瑞氏．姬姆萨染色方法检出率高。关键词：流式细胞术；巨核细胞；DNA倍体；CD41a中图分类号：R446．1文献标识码：ADOI：10．3969／j．issn．1671．3141．2014．01．013StudyofmethordfordetectingMicromegakaryocytesbyusingflowcytometryABSTRACT：ObjectiveThestudyanalysedtheDNAploidofthebonemarrow

3、megakaryocytesbyflowcytometry,whichprovidethedependableexperimentfoundationformeasuringmicromegaka．ryocyte．Methods1．In42casesofMDSpatients，theirbonemarowmegakaryOc、，teswerecountedandclassifiedbycellsdifferentiationstage．2．ThebonemarrowmegakaryocyteswereobtainedbyPercolldens!tygradi

4、entseparationmedium．ThemegakaryocyteglycoproteinIIb／IIIa(CD41a)weremarkedwithfluoresceiniSOthiocyanatethroughitscorrespondingmonoclonalantibody,andcellsDNAweremarkedwithPI．Thenthemegakaryocyteploidywasanalyzedbyflowcytometry(FCM)．Results：Themethodformicromegakaryocytesidentificatio

5、nandanlysiswasestablished．whichwasbasedonCD4laandPIdouble．1abeledFCManalysis．ConelusionsThemicromegakaryocytesdetectionrateoftheflowc~ometrywithCD41aandPIdoublemarkeriShigherthanthatintheWright．Giemsastaining．KEYW0RDS：flowc~ometry；megakaryocyte：DNAploidy：CD4la，O引吾1．2．4骨髓巨核细胞的免疫荧光染色

6、巨核细胞是人体骨髓中唯一的多倍体细胞，生成血小将分离富集好的巨核细胞悬液用PBS调成(2—3)板参与止血、凝血，血小板生成的质与量与其分化发育及×10。／ml。然后PERM按照操作规程(1：10)稀释；加入倍体分布的情况紧密相关。在体外培养实验中，由于巨核稀释后的PERM破膜剂5001，混匀，室温放置10min加细胞不能增殖成熟并形成多倍体化，仅用化学染色的方法入2mlPBS，400g离心5min，弃上清。加入CD41a—FITC很难准确识别细胞，对巨核细胞更进一步的研究有所限制。10l，混匀，避光，室温下放置20min。加2mlPBS，lO0g本文探讨利用

7、单克隆抗体特异性结合的特点，通过流式细离心7min，弃上清。加入RNase100l，放入37℃水浴箱，胞仪对巨核细胞的特异性抗体识别，加上碘化丙啶(PI)指孵育30min。将细胞悬液调整500l左右，加入5mg／mlPI标，获得巨核细胞的倍体数，来精确识别、鉴定小巨核细胞。用于巨核细胞DNA的标记。用200目尼龙网过滤。2h内使为临床提供更为可靠、准确的小巨核细胞数量、倍体和性用流式细胞仪进行检测。质的数据。1．2．5流式细胞仪的校准操作及样本检测充分摇匀校准微球。1号Falcon管中加入1ml鞘液，未l资料与方法标记微球、APC微球各一滴，混匀。2号Fal

8、con管中加入1．1研究对象3ml鞘液，FITC微球