植物体超氧阴离子自由基不同检测方法的比较.pdf

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1、第31卷第5期环境化学Vo1．31，No．52012芷5月ENVIRONMENTALCHEMIsTRYMav20l2植物体超氧阴离子自由基不同检测方法的比较汪承润何梅李月云姜传军田刘敏王勤英(淮南师范学院生命科学系，淮南，232001)摘要应用顺磁共振波谱仪(EPR)自旋捕获法、羟胺氧化法、二氢乙锭(DHE)荧光探针和硝基四氮唑蓝(NBT)原位显色法，分别检测了暴露于梯度镉(cd)溶液2d后的水稻幼苗根叶组织超氧阴离子自由基(0一)的变化水平．结果表明，O—0mg·Lcd诱导了O一随着cd剂量的增加而升高，高于此剂量范围则呈现下降趋势．4种方法的检测结果基本一致，但

2、前两种方法更适用于定量O一的生成水平，而后两种显色方法仅能反映O一的变化趋势，难以精确定量．因此，可以选择性地应用4种方法揭示暴露于污染物的植物组织0一的响应水平．关键词活性氧自由基(ROS)，顺磁共振波谱仪(EPR)，羟胺氧化法，二氢乙锭(DHE)荧光探针，原位显色．植物体内的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)通常存在超氧阴离子自由基(0一)、过氧化氢(HO)、羟基自由基(OH·)、单线态氧(O：)、氢过氧基(H00·)、脂质自由基(R·)、脂氧自由基(RO·)和脂质过氧自由基(RO0·)等类型．其中，O一、H：0、OH·和。0：等活性氧

3、可以相互转化，通过协同作用，形成一个复杂的反应网络．在叶片等含有叶绿素的组织和细胞中，在光照条件下，ROS主要产生于叶绿体和过氧化物酶体，而在根部等不含叶绿素的组织和细胞中以及黑暗条件下的绿色组织，ROS主要来源于线粒体．大量研究结果表明，当生物体遭受污染物胁迫时，体内活性氧的产生将大大增加，当超出生物体的抗氧化防御能力时，能够氧化不饱和脂肪酸、蛋白质和核酸分子，导致膜脂质过氧化、酶蛋白失活、DNA损伤，甚至细胞坏死等J．因此，活性氧的大量产生和积累可作为生物体氧化胁迫的信号7]．ROS也因此被认为是污染物致毒的重要途径和机制．近年来的研究结果还表明，活性氧还参与细

4、胞的信号转导和生理响应的诱导，是植物组织细胞的一类重要的信号分子J．因此，研究植物体活性氧自由基的测定和定量方法对污染物致毒的早期预警及其微观机理的揭示都具有重要的理论意义．由于生物体活性氧的寿命极其短暂，如O一在水溶液中的存活时间为1S，·OH的寿命则仅为10～s，加之组织中活性氧的浓度极低，导致其定性和定量极为困难．O一是生物体最初生成的自由基，又是氧自由基的前体，可以转化成其它种类氧自由基J．因此，对O一的捕获和测定尤显重要．研究发现，O一可以与1，2一二羟基苯．3，5．二磺酸钠(Tiron)快速反应生成一种称之为“Tiron半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定

5、，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O一的定性和定量问题_9J．EPR自旋捕捉技术要求的实验条件比较严格，而且需要EPR这样昂贵的实验仪器，一般研究者很难具备，限制了其推广和普及．王爱国等叩研究报道，O一与羟胺反应生成NO；，NO2-在对-氨基苯磺酸和．萘胺作用下生成粉红色的偶氮染料，该溶液在波长530nm下有显著性吸收值，根据标准曲线可以计算出样品中的O一含量．这种羟胺氧化法利用普通的紫外分光光度计即可完成测定．除此之外，植物组织0一还可应用特异性荧光探针(Dihydroethidium，DHE)或普通的

6、捕获剂如氯化硝基四氮唑蓝(NBT)进行原位捕获和显色．DHE被活细胞摄入后，在细胞内O一作用下脱氢产生溴化乙锭，后者进一步与胞内DNA或RNA结合产生红色荧2011年9月21日收稿．国家自然科学基金项目(20877032)；污染控制与资源化研究国家重点实验室开放基金项目(PCRRF10020)；安徽省自然科学基金面上项目(1208085MB17)；安徽省高校省级自然科学研究重点项目(KJ2012Z381)资助．$通讯联系人，E—mail：chengrunwang@163．corn5期汪承润等：植物体超氧阴离子自由基不同检测方法的比较光．细胞内O一越多，生成的红色荧光

7、就越强，反之则较弱．因此，DHE可用于检测植物组织细胞内O一Ⅲ．NBT显色法的原理是NBT与细胞内O一反应生成蓝色甲腙的斑点，可原位显示O一的存在，而且其斑点密度与O一含量相关，是研究植物叶片组织O一的常规方法．本实验以水稻幼苗作为受试植物，探讨镉诱导下水稻根叶组织O一产量的变化，在此基础上比较4种不同检测方法的异同点和可行性，为准确测定植物组织O一提供方法借鉴和参考．1材料和方法1．1生化试剂氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、SOD酶标准品购自SigmaChemical(St．Louis，MO，USA)；1，2一二羟基苯一3，5。二磺酸钠(Tiron)购自AlfaA