两种不同土鳖虫肠道菌群总 DNA 提取方法的比较及 ERIC-PCR 指纹图谱分析.pdf

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1、动物医学进展。2014，35(5)：85—89ProgressinVeterinaryMedicine两种不同土鳖虫肠道菌群总DNA提取方法的比较及ERIC—PCR指纹图谱分析苏双良，王慧，李洪萍。，白秀娟¨(1．东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030；2．吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118)摘要：比较不同方法提取土鳖虫肠道茵群总DNA的差异，并对土鳖虫肠道菌群组成多样性进行分析。采用试剂盒法和CTAB法提取土鳖虫肠道茵群总DNA，检测其浓度和纯度，扩增16SDNA进行鉴定，并利用ERIC-PCR技术对土鳖虫肠道茵群多样性进行比较分析。结果显示，两种

2、方法均能提取DNA，用于16SDNA的扩增和ERIC_PCR分析，可用于进行土鳖虫肠道茵群的分子生态研究，CTAB法更能反应土鳖虫肠道茵群的多样性。关键词：土鳖虫；肠道茵群；总DNA提取；ERIC-PCR中图分类号：S855．12文献标识码：A文章编号：10o7—5038(2O14)O5—0085—05肠杆菌基因间保守重复序列(enterobacteria1Gelred染料，购自美国Biotium公司；西班牙琼脂糖repetitiveintergenicconsensus，ERIC)首先由BiowestAgarose，购自哈尔滨伊事达生物公司；TI-SharplesGJ等于1

3、990年在E．coli中发现，命名ANampStoolDNAKit粪便基因组DNA提取试剂为“基因间重复单位(intergenicrepeatunit，IRU)”。盒，购白天根生化科技(北京)有限公司；PCR扩增在ERIC的中心有一段保守性很高的反向重复序引物(16S-1：5一AGAGTTTGATCATGGCTCAG一列，该序列长约44bp。VersalovicJ等[2根据这一3；16S-2：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT一3)，ERIC核心序列设计了反向引物，进行PCR扩增得(ERIC1：5一ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC_3；ERIC2：5r_

4、AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG到了一系列由大小不同的片段组成的DNA指纹图3)由北京六合华大基因科技有限公司合成。谱，可区别不同细菌的基因组，用于细菌的分类与鉴1．1．2土鳖虫样本取鲜活土鳖虫5只，断头，无定。ERIC-PCR技术不仅具有分辨率高、敏度性高，菌条件下挑取肠道获取肠道内容物，置于已灭菌的重复性高的特点，而且还具有成本低、操作简便、快1．5mL冻存管中，液氮冷冻后于一76℃冷冻保存，速检测的优势，其指纹图谱能够反映细菌基因组组已备后续提取细菌DNA。成和微生物种群的多样性与群落结构[3]。应用1．1．3主要仪器与设备离心机(TGL-16B)，上海ER

5、IC-PCR对肠道菌群的研究多集中于人类医学方安亨科学仪器厂产品；超净工作台(DL-CJ—ZND)，北面，猪、鸡、大熊猫以及鱼类等的肠道菌群分析上京东联哈尔仪器制造有限公司产品；PCR仪(ham—研究报道已有开展，但未见其在土鳖虫肠道微生物burg22331)，德国EppendorfAG公司产品；Nano-上研究报道。本研究利用两种方法对土鳖虫肠道微Drop2000分光光度计，美国ThermoScientific公生物总DNA进行提取，利用ERIC-PCR技术对其司产品；水平电泳仪(JY600)，北京市君意机电有限指纹图谱进行初步分析，为土鳖虫的深入研究提供公司产品；凝胶成像

6、分析仪(SmartGelTMII)，北京支撑。赛智创业科技有限公司产品。1材料与方法1。2方法1．1材料1．2．1土鳖虫肠道茵群总DNA的提取采用试1．1．1主要试剂RNaseA(20mg／mL)，Taq酶剂盒法及CTAB法对土鳖虫肠道菌群总DNA进行(5U／uL)、10×PCRbuffer(Mg)，6×loading提取①试剂盒法。TIANampStoolDNAKit粪便基buffer、dNTP，购自北京全式金生物技术有限公司；因组DNA提取试剂盒，按使用说明进行操作。②收稿日期：2013—12—05作者简介：苏双良(1988一)，男，河北衡水人，博士研究生，主要从事特种经

7、济动物饲养。*通讯作者86动物医学进展2014年第35卷第5期(总第251期)CTAB法。参考文献[9]进行：取0．3g样品放人灭(5U／ttL)，无菌重蒸水补至50L。PCR扩增程菌好的1．5mLEP管中，加入1mLPBS缓冲溶液，序：94℃5min；94℃30S，55℃30S，72℃3min，充分振荡5min~10min；3000r／mim离心5min，3O个循环；72℃7rnin，4℃结束反应。收集上清液；13000r／min离心5min，弃上清液；加1．2．4ERIC_PCR反应利用扩增引物ER