大鼠肝微粒体的制备.doc

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1、2.1.3大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物SD大鼠，20只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30mg·kg-1），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。3．灌流好的肝脏取出后按1：4比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA,0.25M蔗糖）的匀浆管

2、内，剪碎，匀浆。4．将匀浆液倒入50mL高速离心管中在4℃条件下9000g离心20min。5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g离心60min。6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中,4℃条件下100000g再离心60min，得到的沉淀即为肝微粒体。7．将肝微粒体重悬于0.1M磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mMEDTA，0.25M蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowryet.al.方法

3、(Lowryetal.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A和蛋白浓度C进行线性回归并绘制标准曲线。同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。9．肝微粒体中P450酶含量测定根据OmuraandSato的方法(OmuraandSato,1964)，用Tris-HCl缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3−0.5mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400nm～500nm扫描基

4、线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO气体30s，再次扫描，记录450nm和490nm处的吸光度，按Beer定律（公式2.1）计算CYP450的含量。CYP450(nmol/mgprotein)=(A(450－490)×1000)/(91×C)(2.1)其中，A(450－490)为450nm和490nm处的吸光度之差，91为CYP450-CO结合物的摩尔消光系数，C为肝微粒体样品的蛋白浓度（mg/mL。实验五肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450氧化酶活性测定一、目的

5、要求1.掌握肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450氧化酶活性测定方法。二、实验原理外来化学物质在体内的生物转化主要靠肝细胞内滑面内质网上细胞色素P450酶（CYP450）系进行氧化、还原、水解等代谢。许多药物对细胞色素P450酶系活性有抑制或诱导作用，当与其他需经CYP450代谢的药物联合应用时，会影响这类药物的代谢，从而产生药物相互作用。制备肝细胞微粒体，并测定其内细胞色素P450酶系的含量与活性，可为进一步研究外来化学物质物对肝微粒体细胞色素P450酶系的影响提供依据。肝微粒体细胞色素P450酶

6、系活性测定中，本实验首先应用Lowery法测定肝微粒体蛋白浓度，其显色原理为Flion酚试剂与蛋白质的酪氨酸和色氨酸残基反应所致。细胞色素P450含量测定采用CO还原差示光谱法，还原型细胞色素P450可与一氧化碳结合，在波长450nm处出现最大吸收峰，因此可应用紫外分光光度计于波长450nm处进行测定，而氧化型细胞色素b5经还原剂作用后转变成还原型细胞色素b5，在波长423nm处呈最大吸收，因此可通过测定还原型与氧化型细胞色素b5的差示光谱来进行。三、仪器与试剂实验动物：Wistar大鼠，雄性，体

7、重212±13g。主要试剂：羧甲基纤维素钠，氨基吡啉，红霉素，7-乙氧基香豆素，NADPH，牛血清白蛋白，甲醛。实验仪器：紫外/可见光分光光度计，荧光分光光度计。四、实验步骤1.给药：8只雄性Wistar大鼠，给予0.25%羧甲基纤维素钠1ml，每日灌胃1次，连续7d。d7，禁食1夜，次日断头处死。2.动物处理与肝微粒体蛋白的测定大鼠断头处死，尽量放出血液，迅速打开腹腔，取出肝脏，用0.15mol·L-1KCL-0.2mol·L-1蔗糖（pH7.5）洗净表面血污，用滤纸吸去表面血液，称肝重。将肝脏

8、剪碎，用上述缓冲液洗2次，充分去除肝脏血液。按每克肝脏组织加3ml缓冲液的比例加入0.15mol·L-1KCL-0.2mol·L-1蔗糖，用内切式组织匀浆机在冰浴中制成匀浆；10000×g，4℃离心20min。取上清液转移至超速离心管内，105000×g，4℃离心60min。弃上清，淡红色沉淀物即为肝微粒体。将肝微粒体沉淀取出后用0.05mol·L-1Tris-0.25mol·L-1蔗糖（pH7.5）悬浮，经超声细胞粉碎仪混匀后，分装于冻存管中，干冰速冻后，置-70℃冰箱保存。大鼠