葛根通脉饮诱导血管平滑肌细胞凋亡的实验研究.pdf

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1、国眶

2、国啊目墨■2014年8月第12卷第24期·实验研究·69葛根通脉饮诱导血管平滑肌细胞凋亡的实验研究陈芳郜新莲沈晓君赵君玫(1河南省人民医院，河南郑州450003；2河南中医学院，河南郑州450008)【摘要】目的研究葛根通脉饮对同型半胱氨酸(homocysteinemia，HCY)诱导增殖大鼠血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)的促凋亡作用。方法制备葛根通脉饮含药血清，大鼠VSMC原代培养、鉴定，分为空白组、HCY组、葛根通脉饮组、瑞舒伐他汀(可定)组、葛根通脉饮联合可定组。药物

3、干预后，Annexin／PI双染法检测细胞凋亡率。结果与空白组比较，HCY组细胞凋亡率显著降低(尸<0．O1)；与HCY组比较，葛根通脉饮组、可定组、葛根通脉饮联合可定组细胞凋亡率显著升高(P<0．O5，P

4、cularsmoothmusclecell，VSMC)过度增温透化15min，滴加30“L血清封闭液(二抗宿主来源)，室温封闭殖是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)形成的主要病理机制之30rain。加入一抗d-SMA抗体(1：50)，4℃孵育过夜。加入FITC一抑制VSMC增殖是防止AS病变发生发展、减轻血管重构的的关标记羊抗小鼠二抗(1：100)，37℃孵育30min，同时加4’，6Z．，键⋯。本实验通过观察我院的院内制剂葛根通脉饮对同型半胱氨酸脒基一2-苯吲哚盐酸(4’，6-diamino一2一phen

5、ylindole，DAPI)染细胞(homocysteinemia，HCY)诱导增殖大鼠VSMC的促凋亡作用，探讨核，37℃孵育30min，封片后荧光显微镜下观察。其抗动脉粥样硬化的机制，为葛根通脉饮临床应用提供实验依据。1．2．3细胞分组与药物干预1材料与方法取生长状态良好的细胞胰酶消化，制备细胞悬液，调整细胞浓度为1．1材料1×10／mL。将处理好的盖玻片放人6孔板各孔中，每孔准确接种900¨L1．1．1葛根通脉饮和瑞舒伐他汀(可定)含药血清制备细胞悬液，继续培养后将细胞分为空白组、HCY组、葛根通脉饮组、瑞葛根通脉饮由

6、葛根30g、山楂15g、太子参12g、当归尾6g、淫羊舒伐他汀(可定)组、葛根通脉饮联合可定组。除空白组外，各组均加藿6g赤芍6g，Jling6g、甘草6g等组成，药材购自河南中医学院第一入剂量为10mol／L同型半胱氨酸，培养24h后，葛根通脉饮组加入葛根附属医院中药房并由制剂室制备成中药汤剂。瑞舒伐他汀(可定)，通脉饮含药血清，可定组加入可定含药血清，葛根通脉饮联合可定组同阿斯利康制药有限公司，国A2002002。新西兰大白兔给药剂量为临床时加入葛根通脉饮、可定含药血清，培养48h后，收集细胞。用药剂量的5倍，每日剂量分

7、2次灌胃，连续5d，末次给药后1h，腹主1．2．4AnnexinV-PI法检测细胞凋亡率动脉取血，离心、分离备用。各组细胞用PBS洗涤，0．125％胰蛋白酶消化，转移至离心管，加1．1．2主要仪器与试剂培养液，混匀，1000r／min离心，弃上清，)'JIPBS，重悬细胞，调整CO2恒温培养箱(德国Heraeus公司)；FACSCalibur流式细胞仪细胞浓度为106／mL，取0．5mL细胞悬液，1000r／min离心4min，弃上(BD．USA公司产品)fFLUOVIEWFV100共聚焦荧光显微镜(日本清，No．5mLBi

8、ndingBufer，重悬细胞，加1L荧光标记的annexinOLYMPUS公司)；DMEM、胰蛋白酶(GibcoBRL．USA产品)；IV试剂，混匀，室温下避光孵育20min，加人PI5L，混匀后4℃下型胶原酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)；o【一SMA抗体(武汉避光孵育5min，加入BindingBufer500uL，随即用流式细胞仪检测博士德公司产品)；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物各组细胞凋亡率，用Flowmax2．4软件进行数据处理。公司产品)。1．2．5数据统计与

9、分析l

10、2方法各组细胞测定值以均数±标准差(±S)表示，使用SPSS10．0k1．2．1大鼠VSMC原代培养件包进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。雄性wistar大鼠，体质量200~250g，购自湖北省动物实验中心。2结果戊巴比妥钠腹腔麻醉后迅速分离、取出腹主动脉，小心剥除血管