大豆高盐胁迫下根部组织酵母双杂交文库的构建与分析-论文.pdf

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1、上海农业学报2013，29(6)：20—23ActaAgriculturaeShanghai文章编号：1000—3924(2013)06—020—04大豆高盐胁迫下根部组织酵母双杂交文库的构建与分析何晓兰，许玲，徐照龙，卫陪陪，刘晓庆，黄益洪，张大勇(江苏省农业生物学重点实验室，江苏省农业科学院农业生物技术研究所，南京210014；南京农业大学生命科学学院，南京210095)摘要：为了高效研究大豆耐非生物胁迫的分子调控网络，运用SMART(SwitchingMechanismat5’EndoftheRNATranscript)与DSN(Duplex—SpecificNul

2、ease)相结合的技术构建了栽培大豆高盐胁迫下根部组织的酵母双杂交cDNA文库。提取高质量的总RNA，利用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA后，经DSN处理，然后利用Advantage2聚合酶进行长片段PCR扩增，电泳检测显示，产物均一，无高丰度条带，片段范围在0．75～5．[)(】kb；RT—PCR结果显示，GmActin基因在均一化后表达明显降低，表明均一化效果较好；最后通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株Y187中构建了酵母双杂交所需的cDNA文库。文库质量检测结果表明：cDNA文库的总独立克隆数为5．61X10cfu、文库滴度为3．4X10cfu／mL、

3、重组率大于90％、插入片段长度为0．5～30kb，主要集中在1．0kb左右。关键词：大豆；根；酵母双杂交文库；耐盐性；互作蛋白中图分类号：$565．1；Q78文献标识码：AConstructionandanalysisofayeasttwo—hybrideDNAlibraryofsoybeanroottissueunderhighsaltstressHEXiao—lan，XULing，XUZhao-long，WEIPei-pei，LIUXiao-qing，HUANGYi-hong．ZHANGDa·yong(ProvincialKeyLaboratoryofAgrobiol

4、ogy，InstituteofBiotechnology，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China；Collegeoflifescience，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)Abstract：Inordertoelucidatethemolecularregulationnetworksforsoybeantolerancetoabioticstresses，ayeasttwo．hybridcDNAlibraryfromsoybean

5、roottissueunderhighsaltstresswasconstructedusingSMART(SwitchingMechanismat5’EndoftheRNATranscript)combinedwithDSN(Duplex-SpecificNulease)technique．Thehigh-qualitytotalRNAwasisolatedandsubjectedtoreversetranscriptionusingOligo(dT)16，andthedouble．strandcDNAsweresynthesizedandfurthertreatedw

6、ithDSN，thenlongfragmentPCRamplificationwasperformedusingAdvantage2polymerase，electrophoresisresultsshowedthatthebetterhomogeneousdegreeofPCRproductsrangedfrom0．75—5．O0kbinlengthandtheexpressionofGmActinsignificantlydecreasedbyRT—PCRafterhomogenization．Byusinghomologousrecombinationreactio

7、n，thedscDNAsweretransformedintotheY187yeastcompetentcellwiththelibraryplasmidpGADT7．Rec2toconstructtheyeasttwo．hybridcDNAlibrary．Detectionofthelibraryqualitydemonstratedthatitcontainedatotalof5．61x10。cfuindependentyeastclones，thecapacityofthelibrarywasupto3．4x10cfu／