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1、第八组大鼠乳鼠骨骼肌原代培养与传代培养设计方法及安排一，前期消毒工作：1实验地点消毒：无菌培养室，1%新洁尔灭拖洗地面，紫外线照射消毒30-50min；超净工作台，用75%酒精消毒,然后用紫外线消毒30mino2实验人员消毒：头部戴口罩帽了，身体穿特定的已消毒的工作服，手要剪指甲并用0.2%新洁尔，灭戴手套。进入实验室要换干净的鞋。3实验仪器消毒：a玻璃器1111：5%盐酸浸泡过夜，清洗剂刷洗晾干，浓硫酸重锯酸钾浸酸24h,流水冲洗10次蒸馆水清洗5次。b胶塞：冲洗，浸泡加2%NaOH沸15min,自来水冲洗，2%HC1点沸1
2、5min,自来水冲洗5次，蒸锚水冲洗5次，蒸帼水煮沸lOmin,蒸帼水冲洗晾干，放于金属盒内65KPa高压灭菌15min0c槊•料：2%NaOH碱浸泡过夜，自來水冲洗，5%酸浸泡30min,蒸镭水冲干备用，包装好101.3KPa高压灭菌15min。d金属:汽汕除脂，水洗,酒精拭擦晾干,包装好101.3kPa灭菌15mino二，实验前准备：1常用设备：超净工作台，CO?培养箱，干燥箱，冰箱，高压锅，电子天平，离心机，倒置显微镜，液氮罐，恒温水浴锅。2器皿，器械：培养瓶，培养皿,滴流瓶,三角烧瓶,（刻度）吸管,滴管,离心管,烧杯,
3、注射器，量筒量杯，冻存管，银了，剪刀，弯头剪，胶塞，胶头，瓶盖，微孔滤膜，血细胞计数板，3试剂：0.2%新洁尔火，75%乙醉，0.25%胰酶液，PBS或D-Hank,s液（平衡盐溶液），胎牛血清，3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO?溶液或HEPES溶液（拜乙基哌嗪乙硫磺酸），庆大霉素200ng/ml,0.4%台盼蓝溶液，MMT（I壅哇蓝），DMSO,完全培养基的组成（合成培养基80%—95%,血清5%—20%,碳酸氢钠2.0g/L,青、链霉素各100单位/亳升）三，实验方法：1将新生大鼠乳鼠用颈椎脱臼法处死，用75%乙醉
4、进行腿部消毒，在超净工作台上用手术剪手术刀手术银，取肌肉于平皿中，用Hanks液洗3次。尽可能将周围的结缔组织和脂肪组织剔除干净，将肌肉剪成0.1mm3大小。2将剪碎的肌肉移至离心管屮，用Hanks液洗3次，静置1分钟，弃去上层液及漂浮物.3向上述离心管加入0.25%胰酶,37°C消化20min,每隔数分钟摇动或吸吹细胞液。加入含血清的培养液终止消化。（或分步消化10分钟三次，过筛后马上终止消化，细胞团继续加入酶液消化，三次后离心管加入血清培养液终止消化后过筛）4反复吹打细胞液,并依次100,200,400目过筛,1000r/
5、min离心］Omin。5弃去清液用生长培养基重悬细胞，将细胞移到未被PPL包被的培养瓶屮，差速贴壁除去成纤维细胞，培养lh,移到被PPL包被的细胞培养瓶屮，取样进行细胞计数，并适当稀释细胞悬液3x1（/个/ml分装培养，用生长培养基培养，毎天定时观察细胞生长状况及生长环境。6当细胞基本铺满培养瓶（80%左右），进行传代。7吸走培养瓶内培养液，加入Hanks液。8摇匀后倒去，加入0.25%胰酶消化液消化，数分钟后倒去。9加入新的培养液培养。注：目的意义，学习和掌握细胞原代和传代培养技术。可体外更深一步研究骨骼肌细胞的功能结构。为
6、肌肉受损的机体植入新的肌肉恢复活动功能。培养液颜色：pH7・2〜7.4：培养液桃红色，清亮透明pH<7.2：培养液颜色变浅、变黄pH>7.4：培养液颜色变深、变红工作人员：黄家荣(c),黄敷泽(z),温智袁(w)工作分配：仪器清洗消毒(w),培养液等溶液配制(c,z)。杀鼠、剪取肌肉组织块(z)。剔净多余组织并剪碎肌肉(w)。Hank's液清洗及组织块消化(c)。消化期间z计时而c、W清洗剪刀等器械。C将细胞悬液取样等级稀释，W进行染色，Z进行细胞计数并做笔记记录。C计算细胞密度，W将细胞液进行稀释并分装培养，仪器淸洗W。观察
7、细胞生长及换液(c,Z,W轮值)。试剂配制：%1细胞PBS配方：将药品(NaC18.0g,KC10.3g,Na2HPO4-H2O1.83g,KH2FO40.02g)倒入盛有双蒸水的烧杯屮，玻璃棒搅动，充分溶解，然示把溶液倒入容最瓶屮准确定容至100ml,用时稀释10倍摇匀即成新配制的PBS溶液。高压消毒即可。%1RPMI1640溶解：将1640干粉培养基溶于500ml的三蒸水屮，再用三蒸水冲洗装内部3次，倒入培养液屮，以保证所有干粉都溶解成培养液。b、搅拌：在磁力搅拌器屮进行磁力搅拌使干粉充分溶解。c、调PH:测定pH值，如果
8、pH值在7.0左右则进行下一步，反Z,要用HC1或NaHCO3将溶液的pH值调到7.0。d、加抗生索：加庆大霉索两刀单位，用容量瓶泄容成lOOOrnLe、除菌：过滤法除菌。f、分装：分装于玻璃瓶中，置冰箱保存备用。g、加血清：使用时加血清，使培养液屮血清浓度为20%oh、加入
