农杆菌介导wrkyⅱ基因转化马铃薯抗旱性研究

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1、2012.4作物杂志Crops农杆菌介导WRKYⅡ基因转化马铃薯抗旱性研究111112张欢张丽莉卢翠华王石潘映雪林忠平12(东北农业大学农学院，150030，黑龙江哈尔滨;北京大学生命科学学院，100871，北京)摘要以马铃薯品种东农308和费乌瑞它微北农业大学提供)。供试农杆菌菌种为LBA4404，型薯为外植体，利用农杆菌介导法，将抗逆基因植物表达载体为利用Ubi启动子驱动的p3300-p3300-Ubi-WRKYⅡ导入马铃薯，经PCR和South-Ubi-WRKYⅡ(991bp)基因表达质粒(图1)(由北京ern-blot杂交检测，东农308和费乌瑞

2、它分别有7株大学生命科学学院林忠平教授提供)。和5株呈阳性，证明p3300-Ubi-WRKYⅡ基因已整合到马铃薯基因组中。将转基因植株进行抗旱性试验，结果表明，转基因植株对水分胁迫的抗性比对照有显著提高。关键词马铃薯;农杆菌介导法;WRKYⅡ基因;抗旱性马铃薯是我国种植分布最广泛的农作物之一，是我国第四大粮食作物，在人们的日常生活和国民［1］经济中起着举足轻重的作用。我国的耕地资源有限，淡水资源匮乏，越来越多的研究集中在如何改图1p3300-Ubi-WRKYⅡ植物表达质粒结构示意图良马铃薯对逆境胁迫的抗性上。各种胁迫中，干旱1.2遗传转化体系的优化对马铃

3、薯的影响尤为突出，是影响马铃薯生长和产1.2.1不同激素处理对薯片再生的影响以MS量的主要环境因子之一。由于植物的非生物胁迫抗培养基为基础添加生长调节剂玉米素(ZT)和吲哚性大多属于数量性状，现有的马铃薯种质基础中缺乙酸(IAA)，设计16种组合(见表1)，筛选最佳激乏优异的基因资源，如采用常规育种技术，耗时费素浓度配比。力，困难大。利用转基因技术可以将有价值的基因转入现有的优良品种中，又不改变品种本身所特有表1薯片再生培养基的激素配比mg/L［2－3］的优良性状，在较短的时间内获得新材料。本培养基ZTIAA培养基ZTIAA试验所用的WRKYⅡ转录因子是

4、从厚叶旋蒴苣苔中M13.00.6M94.00.6M23.00.8M104.00.8克隆，并经过加工改造得到，与植物的生物胁迫应答M33.01.0M114.01.0以及干旱、低温、盐碱等非生物胁迫应答密切相关。M43.01.2M124.01.2将其导入马铃薯品种东农308和费乌瑞它中，期望M53.50.6M134.50.6获得抗旱的马铃薯材料，为马铃薯抗性育种提供新M63.50.8M144.50.8M73.51.0M154.51.0资源。M83.51.2M164.51.21材料与方法1.2.2菌液浓度及侵染时间对遗传转化的影响1.1试验材料和菌株薯片侵染时

5、综合考虑菌液浓度和侵染时间，设计16供试马铃薯品种为东农308和费乌瑞它(由东种组合(见表2)，选择最优处理条件。作者简介:张欢，研究生，研究方向为马铃薯生物技术育种1.2.3共培养时间对遗传转化的影响将农杆菌张丽莉为通讯作者，助理研究员，研究方向为马铃薯生物技术育种侵染后的薯片共培养1d、2d、3d后转入分化培养基基金项目:黑龙江省科技计划项目(GZ11B103);黑龙江省“十一五”科技攻关重大项目(GA06B103-2);国家高技术研究发展中培养20～30d，统计出芽率和污染率，确定最佳共计划(863计划)子课题(2009AA10Z103)培养时间。

6、收稿日期:2012－01－18;修回日期:012－03－1330作物杂志Crops2012.4表2农杆菌不同浓度和侵染时间处理次重复，然后遮盖防雨棚对其进行干旱处理，持续处理OD600值侵染时间(min)处理OD600值侵染时间(min)15d不浇水，取样测定其生理指标:叶片保水力、相A10.253A90.753［5］。对含水量、叶绿素和脯氨酸含量A20.255A100.755薯片再生培养及抗旱试验过程见彩插4图版A30.257A110.757A40.2510A120.75101～8。A50.503A131.003A60.505A141.0052结果与分

7、析A70.507A151.0072.1遗传转化体系的优化A80.5010A161.00102.1.1不同激素对再生情况的影响由图2可以1.2.4脱菌剂对薯片再生的影响把共培养后的看出，东农308和费乌瑞它接种M11培养基薯片诱薯片分别接种于含0、150、300、450、600mg/L的进导出芽率最高，分别为92.8%和85.7%。因此最终口头孢噻肟钠和哈药头孢噻肟钠固体培养基上，15d确定的薯片再生培养基为M11(MS+ZT4.0mg/L+后统计抗生素的抑菌效果。IAA1.0mg/L)。1.2.5选择压力在芽诱导阶段的影响将薯片接种于PPT(phosph

8、inothricin)浓度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.