虾夷扇贝外套膜和肾脏组织cdna文库构建以及est的初步分析

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1、第17卷第3期中国水产科学Vol.17No.32010年5月JournalofFisherySciencesofChinaMay2010虾夷扇贝外套膜和肾脏组织cDNA文库构建以及EST的初步分析11111，21，211，2李云峰，刘卫东，高祥刚，李文姬，刘莹，傅立元，李宏俊，王健，11鲍相渤，赫崇波（1.辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室，辽宁大连116023；2.辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连116029）摘要：利用SMARTcDNA文库构建试剂盒首次构建了健康虾夷扇贝（Mizuhopectenyessoensis）外套膜和肾脏2种组织66的cD

2、NA文库。2个文库容量分别为2.30×10CFU/mL和1.20×10CFU/mL，重组率均超过98%，平均插入片段长度均大于1kb，文库质量符合标准要求。将随机选取的4009个克隆进行5′端测序，得到3884个有效序列（外套膜923个，肾脏2961个），测序成功率96.9%。经过质量控制和拼接，共得到2007条单基因簇（Unigenes），包含363个序列重叠群（Contigs）和1644条单一序列（Singletons）。通过BLASTx和BLASTn搜索比对，共有659个Unigenes（外套膜157个；肾脏-5502个）获得了基因注释（E

3、.84%。对Unigene的功能和分类进行了初步分析，发现多种与免疫相关的基因，如凝集素、超氧化物歧化酶、溶菌酶、大防卫素等。利用SSRIT在线工具对2007条Unigene查找微卫星，发现有69个EST中含有微卫星序列，其中40个可以用于引物设计。虾夷扇贝cDNA文库的成功构建，为进一步的EST分析、功能基因的表达和克隆、多态性EST-SSR的筛选以及虾夷扇贝分子遗传学研究、种质资源评价和分子选育等奠定了基础。[中国水产科学，2010，17（3）：578-585]关键词：虾夷扇贝；cDNA文库；免疫相关基因；EST-SSR中图分类号：Q959.215　　　　　文献标识码：A　　

4、　　　　文章编号：1005-8737-（2010）03-0578-08虾夷扇贝（Mizuhopectenyessoensis）原产于日本扇贝免疫相关基因进行筛选和克隆，并研究扇贝的[5-8]北部及俄罗斯远东地区沿海水域，具有生长快、肉味免疫反应特征和抗病机制。本研究首次建立了鲜美、经济价值高等特点，已成为中国北方主要的经虾夷扇贝2种组织全长cDNA的文库，对其进行EST济养殖贝类之一。近几年，养殖过程中病害频发，出分析，不仅可以获得虾夷扇贝相关的遗传信息，也为现大规模死亡现象，严重制约着该产业的发展，病害进一步克隆与虾夷扇贝生长、分化、免疫等相关基因问题成为制约中国虾夷扇贝产业可

5、持续发展的主要奠定基础，同时还可以通过构建文库筛选用于构建瓶颈之一。为了增强虾夷扇贝群体的抗病性，一方[1-2]遗传连锁图谱的遗传标记，如SSRs和SNPs，而这些面可以进行抗病品种或品系的选育；另一方面可标记在相近物种间相对保守，在比较基因组研究中以通过选择合适的免疫增强剂来提高贝类机体的防御功能[3-4]。目前，对虾夷扇贝抗病基因的克隆和表具有重要价值。通过对这些基因和标记的研究，能达是研究其群体抗病性的基础和关键。更深入地探讨虾夷扇贝生理生化的特性及生长和抗近几年，国内外学者通过构建EST文库方式对病性状有的遗传机制，并用于优良性状的选择。收稿日期：2009-08-15；修

6、订日期：2009-11-12.基金项目：国家海洋公益性行业科技专项项目（200805037）；辽宁省科学技术计划重大、重点项目（2008203001）；辽宁省海洋与渔业科研计划项目（200801）.作者简介：李云峰（1979-），男，硕士，助理研究员，研究方向为水产分子遗传学.E-mail：yunfengli@126.com通讯作者：赫崇波（1961-），男，博士，研究员，研究方向为水产分子遗传学.Tel：0411-84697003；E-mail：hechongbo@hotmail.com第3期李云峰等：虾夷扇贝外套膜和肾脏组织cDNA文库构建以及EST的初步分析5791材料与方

7、法PCR扩增后，计算重组克隆和非重组克隆的比值，确定重组率。1.1材料1.2.3ESTs序列测定和初步分析使用Phred软件实验所用样品为2龄健康虾夷扇贝，于2008年去除低质量序列（<100bp），Phd2fasta软件生成序列文8月采自大连市旅顺口龙王塘养殖场，随机选取15件，再用Cross-match软件去除载体和其他污染序列，个个体，分别取其外套膜和肾脏组织，各组织分别混最后用Phrap软件对序列进行拼接并使用Consed软件合后放入液氮中保存。[9]做人工检查和校正。用