线粒体的提取与纯化.doc

《线粒体的提取与纯化.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、mtDNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M蔗糖，0.01MTris·Hcl，0.001MNa2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。1.21000g•min-1离心15min；取上清液；15000g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B（0.25M蔗糖，0.05MTris·Hcl，0.007MMgCl2，pH7.5）洗涤，按0.5mL•g-1肝的比例加入缓冲

2、液B悬浮沉淀后加入DNaseI至终浓度为100µg•mL-1，30℃下作用30min。1.3冰浴冷却，加入2倍体积的DNaseI反应终止液（0.25M蔗糖，0.1MNa2-EDTA，pH8.0）。15000g•min-1离心20min。沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。1.4按0.5mL•g-1肝加入缓冲液C（0.1MNacl，0.05MTris·Hcl，0.01MNa2-EDTA，pH8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。1.5用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。取水相，加0.2倍体积1

3、MNaAc和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。1.615000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01MTris·Hcl，0.001MNa2-EDTA，pH8.0）溶解。1.7加入预处理的RNaseI至终浓度为50µg•mL-1，37℃保温1h。4℃保存待用。