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时间:2020-04-02
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1、mtDNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法,就具体情况稍加改进,步骤如下(除特别说明,均在4℃下完成):1.1取新鲜肝组织,放在缓冲液A(0.25M蔗糖,0.01MTris·Hcl,0.001MNa2-EDTA,pH8.0)中漂洗2~3次,尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A,用玻璃匀浆器冰浴匀浆。1.21000g•min-1离心15min;取上清液;15000g•min-1离心20min,弃上清,沉淀用缓冲液B(0.25M蔗糖,0.05MTris·Hcl,0.007MMgCl2,pH7.5)洗涤,按0.5mL•g-1肝的比例加入缓冲
2、液B悬浮沉淀后加入DNaseI至终浓度为100µg•mL-1,30℃下作用30min。1.3冰浴冷却,加入2倍体积的DNaseI反应终止液(0.25M蔗糖,0.1MNa2-EDTA,pH8.0)。15000g•min-1离心20min。沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次,重复离心。1.4按0.5mL•g-1肝加入缓冲液C(0.1MNacl,0.05MTris·Hcl,0.01MNa2-EDTA,pH8.5)悬浮沉淀,加入SDS至终浓度为1%~1.5%,吸打混匀后37℃保温15min。1.5用等体积的苯酚,苯酚/氯仿(1:1),氯仿/异戊醇(24:1)各抽提一次。取水相,加0.2倍体积1
3、MNaAc和2倍体积的预冷无水乙醇,混匀后放在4℃冰箱中过夜。1.615000g•min-1离心30min后去上清;沉淀用70%乙醇洗涤2次,干燥,TE(0.01MTris·Hcl,0.001MNa2-EDTA,pH8.0)溶解。1.7加入预处理的RNaseI至终浓度为50µg•mL-1,37℃保温1h。4℃保存待用。
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