小鼠肝细胞培养.doc

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1、小鼠肝细胞培养1材料1.1动物：小鼠。1.2试剂:DMEM(含血清)、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS。13器械：饭盒、纱布、小剪子、小银子、大银子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50ml).6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。1.4准备：酒精擦拭台面麻把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟麻开鼓风机吹至实验结朿。2方法2.1将小鼠断颈致死,置75%酒精泡2・3分钟，取肝脏,置于盛有PBS的平皿中。2.2剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平1111屮。23用手术剪将脏器剪成小块(大小约lmm2)

2、,玻片研磨，转到离心管，离心(1000rpm,5min)。2.4视组织或细胞量加入5・6倍(3-5ml)胰酶,37°C中消化20分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次，使细胞分离。2.5加入3・5ml含血清的培养液以屮止胰酶消化作用。2.6用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。2.7再次离心5min,弃上清液。2.8加入无血清培养液5ml,冲散细胞，再离心一次，弃上清液。2.9加入含血清的培养液1-2ml(视细胞最)，血球计数板计数。2.10将细胞调整到5X105/ml左右，转移至6孔培养板屮，37°C下培养。小鼠胚胎成纤维细

3、胞（MEF）培养1材料1.1动物孕期14至16天的孕鼠（小鼠）。1.2试剂无Ca2+和Mg2+的PBS（D・PBS）、0.05%胰酶、0.53mmol/LEDTA溶液、MEF生长培养基（高糖DMEM加10%FBS）o1-3器械眼科直剪3把、眼科直银3把、眼科弯银2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50ml和15ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。2方法2.1处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然麻在超净台屮用剪刀和锻了将孕鼠皮肤剪开,用另外一纟R剪刀、银了剪开腹部肌层，露岀了宫，最后用第三纟H.剪刀和银了将了宫小心取岀

4、放在盛有D-PBS的玻璃平1111屮，冲洗去血。2.2用两把弯银了将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30mlD-PBS的50ml离心管中,轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS,再重复此步骤一次,注意要留少许D-PBS,然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿屮，并用手术刀片将其细细切碎。2.3用200Ul的移液枪反复、快速地吹打平川冲的液体，转移至15ml离心管屮，于4°C1500rpm离心5分钟，倒掉上清，以10ml胰酶重悬沉淀，放在37°C水浴屮消化30分钟，口每隔五分钟轻轻晃动，使Z充分消化。2.4将上层细胞

5、悬液倒入一个装有10mlMEF生长培养基的50ml离心管屮，用200目的尼龙网过滤示，以1500rpm离心5分钟收集细胞，再用30mlMEF生长培养基洗涤两次。2.5细胞沉淀用15mlMEF生长培养基重悬后进行细胞计数（一般8只14天的胎鼠可获得2-3X107细胞）。2.63X106细胞悬浮于15mlMEF生长培养基中,接种到200ml培养瓶中。2.724小时后更换新鲜的MEF生长培养基。2.8细胞长满示，先用D-PBS冲洗，倒掉后加月夷酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟），按1:5传代。2.9细胞再次长到覆盖率80・90%左

6、右，将其消化后，常规冻存。