hbvtg小鼠原代肝细胞培养及hbvhlaa2.1小鼠的初步应

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1、南方医科大学硕士学位论文HBV-Tg小鼠原代肝细胞培养及HBV-HLA-A2.1小鼠的初步应用姓名：陶鑫申请学位级别：硕士专业：传染内科学指导教师：孔祥平201106／螂嬲HBV-Tg小鼠原代肝细胞培养及HBV／HLA．A2．1小鼠的初步应用硕士研究生：陶鑫指导教师：孔祥平摘要背景一、乙肝感染是严重威胁人类健康的传染性疾病，并且是导致肝纤维化、肝硬化的主要原因。虽然近些年乙肝疫苗的有效接种大大降低了乙肝的发生率，但全世界仍有大约3500万的慢性感染者。因此对乙肝的发病机理、诊断、预防及治疗等研究仍需要我们大力的开展。目前乙肝研究的体外细胞模型以癌系细胞为

2、主，如Hcp02．2．15细胞。虽然其可以稳定分泌HBsAg、HBeAg、Dane颗粒，并可检测到胞内HBV-DNA等优点，但其毕竟是癌系细胞，无法表现出非癌性肝细胞的生理活性，经过长期的传代培养，其表面很重要的药物代谢酶CYP450的表达明显降低，无法很好的对一些有抗病毒效果的药物进行筛选。原代肝细胞培养为药物生物转化途径的研究、寻找药物可能的代谢物提供了一个简单和有效的模型。实践证明了原代肝细胞已经成为CYP450酶密切相关的实验模型。二、乙肝为何易慢性化及如何改变乙肝的慢性化发展是目前国内外乙肝研究的热点，也是难点。有人研究，乙肝之所以易慢性化，是

3、由于乙肝病毒本身抗原物质可以逃避机体的特异性细胞免疫攻击而产生免疫耐受。如何能够打破乙肝患者对乙肝病毒的免疫耐受成为阻断乙肝慢性化的关键。乙肝治疗性免疫疫苗就是根据诱生机体特异性免疫应答来清除HBV病毒的原理而成为研究热点。但是由于种属问存在组织相容性抗原的差异，治疗性乙肝疫苗因为缺乏合中文摘要适的动物模型，而影响对其评价。所以本实验室制备了HBV／HLA-A2．1双转基因小鼠，希望能够解决乙肝治疗性疫苗临床前研究的难题。目的一、建立HBV转基因小鼠(HBV-Tg小鼠)原代肝细胞的分离、培养方法，并观察酒精对HBV-Tg小鼠原代肝细胞的损伤敏感性和对HB

4、sAg分泌的影响。二、观察特异性免疫多肽对HBV／HLA-A2．1双转基因小鼠(册ⅧLA．A2．1dTg小鼠)特异性免疫反应的诱导作用和对病毒学指标HBsAg、HBV-DNA的影响。方法一、采用优化改良的两步灌流法分离培养HBV-Tg小鼠与野生型Balb／e小鼠的原代肝细胞；观察细胞铺板7天内的生长状态，并检测HBV-Tg小鼠原代肝细胞培养上清的白蛋白、尿素、乳酸脱氢酶、HBsAg、HBV-DNA的分泌及表达情况；用酒精做为氧化应激损伤物质，观察对HBV-Tg小鼠与野生型Balb／e小鼠的原代肝细胞的损伤敏感性差异，并观察酒精对HBV-Tg小鼠HBsAg

5、的影响情况。二、用乙肝特异性表位肽皮下免疫HBV-Tg、HLA-A2．1、HBV／HLA-A2．1dTg三种转基因小鼠，一段时间后观察小鼠肝脏组织学损伤改变，脾细胞分泌IFN-丫分泌情况和脾细胞中CD3+、CD4+、CD8+细胞比例。并动态观察小鼠血清HBsAg、HBV-DNA的表达情况。结果一、本实验室采用改良的两步灌注法，对乙肝转基因小鼠原代肝细胞进行培养，我们不仅能够成功分离并培养了HBV-Tg小鼠原代肝细胞，而且产量高，每只小鼠分得细胞总数达107个，经纯化后活细胞比率能达90％；用明胶提前包被的24孔板或者96孔板对其进行培养，每天观察形态学改

6、变，第1天活细胞就基本能铺满培养板底，上层漂一些变圆、不透亮、未贴壁的死细胞。铺下去Ⅱ硕士学位论文的活细胞贴壁完全，细胞呈不等大、多边形，体积变大，胞质多空泡和脂滴，细胞可见2个或2个以上细胞核，第2天有的相邻细胞靠伸长的伪足相互链接，细胞表面积更大，伸展更充分，之后几天细胞形态学改变不大，直到第7天，7d后细胞逐渐回缩，体积变小，透明度降低，培养上清更多的出现圆型、不透亮、脱落的死细胞。收集细胞每天的培养上清，检测白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶及病毒学指标HBsAg和HBV-DNA的表达情况。发现白蛋白水平在2d"-5d水平最高；谷丙转氨酶

7、、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶刚开始水平较高，第2天之后就降低到一个稳定水平；病毒学指标HBsAg和HBV-DNA在铺板5d之内基本能够保持较高的水平；我们以酒精作为氧化应激损伤因素，观察酒精对HBV-Tg以及野生型Balb／c小鼠原代肝细胞的损伤敏感性差异，以及酒精对HBV-Tg小鼠原代肝细胞HBsAg的表达影响，我们发现铺板24h的原代肝细胞经不同浓度酒精(0．13％，0．5％，2％，8％)损伤16h后，检测细胞培养上清AST，两种小鼠的AST水平总体趋势是随着酒精浓度的升高，细胞释放到培养基中的AST逐渐升高。计算两组细胞的特异细胞毒性率。结果示HBV-

8、Tg小鼠原代肝细胞在0．13％、0．5％组抑制率显著低于野生型Balb／e鼠。2