6肿瘤细胞培养和杂交瘤技术[1]

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1、肿瘤细胞的培养姚娟安徽医科大学微生物学教研室1•肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。•肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。2主要内容•体外培养肿瘤细胞的特征•肿瘤细胞系的建立•体外培养肿瘤细胞生物学检测•肿瘤细胞体外培养的应用3一、体外培养肿瘤细胞的特征肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增殖、遗传性状等方面都有显著的不同。41、形态•培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核浆比例大。•

2、电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则。52、生长增殖特点（不受控增殖性）•失去接触抑制，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。•失去锚着依赖性（停泊依赖性），可在琼脂、甲基纤维素等支撑物上生长。6•低血清要求，2%~5%血清仍能生长，成为检测细胞恶变的一个指标。•不依赖生长因子，因其可自分泌产生促增殖因子。•形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。73、永生性•永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡。体外培养中的肿瘤细胞系（株）都表现有这种性状。•永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控。从一些具有永生性而无恶性的细胞系

3、，如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等细胞可以证明。84、致瘤性•细胞接种同种动物或裸鼠后的致瘤性是客观反映细胞恶性程度的指标。•具体做法是：1）收集培养的肿瘤细胞，用无血清培养液洗一遍；2）计数后将0.2ml含2×106～2×107个细胞的细胞悬液注射到动物皮下。约一个月左右（最短在3天后），可见注射局部有肿瘤出现，甚至有转移瘤形成。经病理组织学检查可以确定肿瘤是否由接种的细胞产生。也可接种到腹腔或通过鼠尾静脉注射。95、浸润性•浸润性是肿瘤细胞的扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。•在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。1

4、06、异质性•通过肿瘤细胞培养及克隆分析发现，同一肿瘤是由具有不同生物学特征的细胞亚群构成的。这些细胞亚群的浸润性、生长率、转移能力、核型、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性均不同，这种特性被称为肿瘤细胞的异质性（heterogeneity）。11•同一肿瘤内细胞的活力有差别，有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称肿瘤干细胞。只有肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分。127、细胞遗传•大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。13体外培养肿瘤细胞的三个显著特征：©永生性©不受控增殖性©致瘤性14二、肿瘤细胞系的建立•恶性肿瘤细胞培

5、养建立细胞系，包括从人或动物恶性肿瘤取材建立癌细胞系和正常细胞在体外经理化、生物因素诱发的转化细胞系。•转化细胞系可以是恶性转化细胞和一般转化细胞两种。15•恶性转化细胞系和癌细胞系一样具有永生性和恶性表型，对此两种来源的细胞系鉴定也是相似的，为研究恶性肿瘤提供了有用模型。•一般转化细胞系只具有无限生长能力，不具有恶性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细胞的模型而被应用。16癌细胞系的建立•癌细胞培养的最主要的问题是从体内到体外环境的改变。•培养中发现，有些肿瘤在体内生长，但在体外却难以生长。17肿瘤细胞在体外不易生长的可能原因：①依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一

6、定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性。18②肿瘤细胞的自分泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力。③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的生命周期，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少。④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。19（一）癌细胞原代培养•癌细胞建系的方法和程序相似于正常细胞，包括标本收集和处理、原代培养、传代、换液、冻存、复苏等过程。•培养成功关键

7、在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。201、取材•人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免，要挑选活力较好的部位。•癌性转移淋巴结或胸腹水是很好的培养材料。21•取材后尽快将癌组织进行培养，一般4小时内细胞存活最好。标本在4℃存放，不宜超过24小时。22•人癌细胞建系必须要有完整的记录，包括组织来源、病人姓名、住院号、年龄、性别、临床诊断、病理诊断（应明确分类分期）、术前放化疗情况，为细胞建系的重要材料。•为