sd大鼠骨髓间充质干细胞与其乳鼠该细胞株的细胞表型鉴定比较

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1、广东医学2013年11月第34卷第22期GuangdongMedicalJournalNov．2013，Vo1．34，No．22·3397·SD大鼠骨髓间充质干细胞与其乳鼠该细胞株的细胞表型鉴定比较水卞铁荣，陈枫，邢宏运，唐利泸州医学院附属医院医学实验中心，血液内科(四川泸州546000)【摘要】目的探讨随着传代次数的增加，原代贴壁培养的sD大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)与其乳鼠M$Cs株细胞表型的差异。方法采用密度梯度离心法和贴壁法分离培养sD大鼠MSCs，对分离培养的sD大鼠的MSCs及其乳鼠MSCs株进行传

2、代，倒置相差显微镜比较两种细胞的形态，借助流式细胞技术及免疫组化技术分析两种细胞表型因子的表达差异。结果流式细胞技术鉴定sD大鼠原代培养的第7代MSCs与其乳鼠MSCs株的CDT1、CD44、CD90、CD45的阳性表达是一致的，两种细胞对应的阳性率分别为77％、68．8％、52．3％、0．05％和97．7％、99．7％、87．6％、0．05％；免疫组化分析其CD44、CDT1及阴性对照，两种细胞结果亦吻合，而且CD44和CD71与流式细胞检测结果一致，两种细胞均为阳性表达。结论流式细胞术及免疫组化鉴定原代贴壁培养的

3、第7代SD大鼠的MSCs与乳鼠MSCs株细胞表型一致，支持原代贴壁培养SD大鼠的MSCs3～5代已纯化，可用作转染等科研实验。也已证明传至第6、7代，培养的半数以上的MSCs仍保持干细胞的特征，且与细胞株细胞的增殖能力相当。【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞表型；流式细胞术；免疫组化骨髓间充质干细胞(MSCs)属于多能干细胞，具有DMEM(Gibco公司)；FBS、胰酶、青霉素和链霉素，兔抗自我更新及多向分化潜能，可分化为骨、软骨、脂肪、肌鼠CD44、CD45、CDT1、CD90抗体(北京博奥森生物公腱、肌肉、神经等多

4、种细胞。因此，MSCs所具有的修司)；SP试剂盒(中杉金桥生物技术有限公司)；流式细复、替代和再生的能力有望发展为临床医学新疗法，但胞仪(美国贝克曼库尔特公司，型号XL)。MSCs在骨髓中的含量很少，约占骨髓单核细胞的1／101．2MSCs的生物学特性检测万，并随着年龄的增加而减少⋯。体外贴壁培养法从1．2．1SD大鼠MSCs的分离、培养每次选取周龄3—骨髓筛选的MSCs活性高，且骨髓中的造血干细胞能5周的sD大鼠2只，脊椎脱臼法致死，无菌条件下用分泌生长因子和簇贴壁物质，促进MSCs贴壁生长。PBS液冲洗股骨、胫骨

5、的骨髓腔，离心管收集富含有研究提出在人MSCs传代培养过程中发现，第4～MSCs的细胞悬液，10％胎牛血清的DMEM培养，3d5代之前的细胞增殖能力比较旺盛，以后其活力逐渐全量更换细胞培养液，待细胞融合接近70％～80％时减弱，提示细胞脱离了体内环境之后，逐渐发生退化，传代，传代后为第1代。待第1代融合接近70％一拟建议取用MSCs作实验研究时，细胞的传代次数不80％时，胰酶消化，Percol1分离液(密度1．073)分离，宜超过4～5代。以目前经验，原代贴壁培养法获得的继续培养、传代，传代至第6代长满80％～90％

6、，1瓶SD大鼠的MSCs只用其3—5代。而文献报道MSCs传2瓶，观察细胞传代后2、3d的形貌和增殖。在无诱导剂环境中生长，25代以前，其细胞形态、生长1．2．2SD大鼠乳鼠MSCs株的培养SD大鼠乳鼠的特性、表形特点和分化潜能无明显变化。目前研究该MSCs株细胞培养基与原代培养MSCs相同，该细胞株细胞应用的文献多而广，为了探究清楚MSCs可用买来传至16代，待长满80％～90％，1瓶传2瓶，观察于应用研究的细胞代数，使临床新疗法尽快、尽早、尽细胞传代后2、3d的形貌及增殖。广泛地实施，2012年6月至2013年1

7、月，本研究对原1．3MSCs的细胞表型鉴定代贴壁法培养的SD大鼠的MSCs与其乳鼠的MSCs株1．3．1免疫组化细胞培养方法：原代培养至第6代的细胞表型进行鉴定比较，拟探讨该法培养的细胞5种6孑L板爬片；细胞株细胞传至16代种6孔板爬片备代以后能否继续用于细胞种子来源。用。免疫组化标记用sP染色法，包括CDT1(1：100)、1材料与方法CD44(1：100)、阴性对照(PBS液)，CD71、CD44标记阳性均定位于胞浆内。1．1材料3—5周的SD大鼠(四川泸州医学院动物1．3．2流式细胞仪鉴定MSCs原代培养至第6

8、代后中心)10只，雌雄不拘，体重150～200g；SD大鼠乳鼠1传2，待长满80％～90％消化，备用流式检测；MSCs的MSCs株(广州吉妮欧生物科技有限公司)；高糖株传至16代同原代培养法，以备用流式检测。检测两泸州医学院科研基金资助项目(编号：泸医院科[201212号～12)种细胞表达CI)44、CI)45、CD71、CDg0的百分比。设泸