鸡屎藤愈伤组织诱导及细胞悬浮培养研究

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1、南方农业2010年第5期2010年5月SouthChinaAgricultureNO．52010MaV．2010鸡屎藤愈伤组织诱导及细胞悬浮培养研究赵俊，吴虹丽；马林※(西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010)摘要：建立鸡屎藤愈伤组织的诱导、增殖继代培养及其细胞悬浮培养的技术体系。研究不同植物激素组合对叶片、茎段和带腋芽茎段愈伤组织诱导的影响；采用正交试验研究不同处理对叶片愈伤组织增殖的影响；采用液体振荡培养法测定叶片愈伤组织细胞悬浮生长曲线。结果表明：叶片最易诱导产生愈伤组织，最佳激素配比为MS+6一BA1．0mg／L+NAA0．5mg／L，诱导率可达100％。叶片愈

2、伤组织最佳增殖培养基为MS+2,4-D0．5mg／L+NAA0．3mg／L+6-BA0．5mg／L，pH5．8。由叶片愈伤组织建立的细胞系生长呈“S”型曲线，培养24d达到最大生长量，最适继代周期为18～20d。以叶片为外植体经愈伤诱导、增殖培养可建立良好的细胞悬浮系。关键词：鸡屎藤；愈伤组织；组织培养；细胞悬浮培养鸡屎藤(Paederiascandens)为茜草科鸡屎藤属多年(1)外植体：鸡屎藤采自四川省绵阳市西南科技生草本植物，主要分布在南亚、东北亚、东南亚各国，国大学校园，经绵阳师范学院罗明华教授鉴定为茜草科内主要分布在长江流域以南各省。鸡屎藤具镇痛消炎功鸡屎藤(P．scand

3、ens)。采集时间为4—5月，取生长效，对无名肿毒、跌打损伤等疾病均有疗效nJ。国内外学健壮的幼嫩茎段、带腋芽茎段、叶片为外植体接种。者研究表明鸡屎藤主要含有黄酮类、环烯醚萜类、(2)培养基：愈伤组织诱导及继代培养基是在MS挥发油[9．及酚酸【。等化学成分。现代临床和药理研究表培养基中添加不同浓度的NAA、6-BA、2,4一D；细胞悬明其含有多种生物活陛成分，如鸡屎藤苷、鸡屎藤苷酸浮培养基除了不添加琼脂外，其余成分组成和愈伤组甲酯、槲皮素、咖啡酸等。中药鸡屎藤乙醇提取物对肿织继代培养基相同。每配制1L培养基加入8g琼脂瘤的生长具有显著的抑制作用，其中鸡屎藤苷对肿瘤基和30g蔗糖，除愈

4、伤组织继代培养正交试验外，均调因表达的启动子有很好的抑制作用[】”。pH至5．8，在121℃，1．05×105Pa压力下灭菌20min。野生鸡屎藤资源由于受到人为的过度开发和破(3)仪器与设备：电子天平(TP一213，德国塞多利坏，面积逐渐缩小，而植物组织细胞培养是解决资源斯公司)，高压灭菌锅(LDZX一75KBS，上海申安医疗匮乏的有效途径。国内外对鸡屎藤组织培养的报道器械厂)，单人双面超净工作台(swcJco，苏州净化较少，仅见李任珠等¨。对海南野生鸡屎藤的愈伤诱设备有限公司)，全温振荡培养箱(HZQ一160F，上海导、植株快繁进行了研究，对于鸡屎藤愈伤组织的继齐欣科学仪器有限公

5、司)，光照培养箱(LRH-70，上海代增殖培养、细胞悬浮培养未见相关报道。本试验研蓝豹试验设备有限公司)。NAA、6一BA、和2，4-D均购究了鸡屎藤愈伤组织诱导、增殖培养条件，建立了鸡自上海伯奥生物科技有限公司，其余试剂为分析纯。屎藤悬浮培养细胞系。1．2方法(1)鸡屎藤愈伤组织诱导：将叶片与茎段、带腋1材料与方法芽茎段分开，用自来水反复冲洗干净后，用体积分数1．1材料为70％的乙醇浸泡30S，无菌水冲洗2次。用0．1％的HgC1：进行表面灭菌处理，所有材料灭菌时间均设6、8、1O、12min四个处理，无菌水冲洗5～6次。将茎段作者简介：赵俊(1985一)，男，四川巴中人，在读硕士

6、，主要从事药用植物生物技术及次生代谢产物研究。E-mail：zhaojIll13120o3@yalloo．com．cn。和带腋芽茎段切成长约1cm的小段，叶片切成0．5cm※通讯作者：马林(1964一)，男，四川绵竹人，西南科技大学生命科学与工×0．5cm左右的小块，无菌接种至培养基上。根据接程学院副教授，在读博士，主要从事药用植物天然产物及生物转化研究。53南方农业2010年第5期2010年5月SouthChinaAgricultureNO．52010Mav．2010种8d后外植体变化情况确定最佳灭菌处理时间。2．2愈伤组织的诱导确定最佳灭菌时间后，叶片、茎段和带腋芽茎段(1)NA

7、A与6-BA不同浓度组合对愈伤组织诱导按照最佳灭菌时间处理。接种于含有不同植物激素的影响的MS培养基中，恒温培养箱中(25_-4-0．5)oC培养，将叶片、茎段和带腋芽茎段三种外植体接种到愈伤组织诱导与增殖过程中光照强度1000～1500lx，MS添加6一BA和NAA的6种培养基上进行愈伤组织光照时间12h／d。统计分析各种诱导培养基的愈伤组诱导。表2为培养20d后三种外植体的愈伤组织诱导织诱导率及愈伤组织生长情况。情况。可以看出，不同外植体均能诱导产生愈