顶扣包埋：单层细胞透射电镜制样.docx

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1、顶扣包埋：单层细胞透射电镜制样细胞透射电镜样品的制备最常见的方法是先把贴壁的细胞酶解下来，然后离心成团，最终是对细胞团进行固定、脱水、渗透、包埋、切片和染色，最后是电镜观察。然而有些细胞酶解下来时，会造成细胞内超微结构的改变，如贴壁生长的小鼠成纤维细胞细胞核中存在granule，胰酶消化会导致granule（如图一）的消失，这时需要一种原位处理的制样方法，也就是我们要介绍的顶扣包埋单层细胞透射电镜制样方法。图一、小鼠成纤维细胞。箭头所指为Granule有些细胞对切片方向要求比较严格，可以选用顶扣包埋。比

2、如看到气管上皮细胞的纤毛横截面，顶扣包埋会更适用，能在一个视野看到更多纤毛横截面（如图二）。图二、气管上皮细胞纤毛4以活体皿（玻璃底）培养细胞为例，介绍顶扣包埋的具体操作方法：1.PBS浸洗一次，10min；2.2.5%戊二醛固定，30min；3.PBS浸洗三次，每次10min；4.1%锇酸固定30min；5.乙醇梯度脱水；6.树脂渗透，树脂7.聚合注意：以上操作都在活体皿里进行，尽可能再空气干燥时制样，并做好防潮措施。图三、活体皿中处理细胞，封口膜防潮8.顶扣粘贴再聚合A带玻璃底的活体皿，已完成聚合；

3、图四、已树脂聚合的活体皿B40%的氢氟酸溶解玻璃底15min，水洗，烘干；图五、正在腐蚀活体皿的玻璃底4C从活体皿中取下圆形树脂块，单层细胞在树脂块里；图六、圆形的树脂块D分割圆形树脂块成小块；图七、分割树脂块E用液体树脂粘贴分割的小树脂块到空包埋块上（有细胞一面超外侧），然后再次聚合；图八、粘贴树脂块F修块，为超薄切片做准备；图九、修块41.超薄切片、染色和透射电镜观察。注意事项：1、脱水不要用丙酮。活体皿边缘是塑料材质，易溶于丙酮，在脱水或渗透过程中要避免使用丙酮。2、在活体皿里聚合，所加树脂要适量

4、。聚合所用树脂的量要适量，以刚刚覆盖玻璃底为标准，若太厚会导致分割困难，太薄粘贴时会出现打卷现象，不利于超切。3、氢氟酸腐蚀玻璃的操作要在通风橱进行，并做好防护措施，避免皮肤直接接触氢氟酸。4、粘贴带细胞的小树脂块宜用液体树脂。最好采用树脂再聚合的方式粘贴分割出的小块，这样会需要更长的时间，但粘贴更牢固，这一点在超切中至关重要。速粘胶502虽然粘贴快速，但不牢靠，不建议使用。5、超切要更仔细。由于单层细胞样品厚度只有20μm左右，所以超薄切片前要调整各个方向的角度，尽可能减少样品损失。4