小花棘豆苦马豆素对小白鼠肝脏α-甘露糖苷酶基因相对表达的影响-论文.pdf

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1、·5O·生物技术中国畜牧兽医2014年第41卷第2期小花棘豆苦马豆素对小白鼠肝脏一甘露糖苷酶基因相对表达的影响张建军，韩敏，王宇，白颖。(1．内蒙古农业大学兽医学院，农业部动物临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特010018；2．鄂尔多斯市东胜区动物疫病预防控制中心，内蒙古东胜017000)摘要：本试验旨在研究不同剂量苦马豆素(sw)胃内灌Nd,白鼠，检测其对肝脏a一甘露糖苷酶(AMA)基因在不同时间转录表达的影响。采用动物组织总RNA试剂盒提取肝脏组织总RNA，酶标仪法测定RNA纯度，凝胶电泳检测

2、RNA完整性，实时荧光定量PCR技术检测AMA基因的转录表达水平。结果显示，试验组及对照组AMA基因均有表达，但各试验组中转录表达水平不同，与对照组相比，低剂量SW能促进肝脏AMA基因的表达，且随着试验的进行促进效果更加明显，高剂量和中等剂量SW初期也能提高AMA基因的相对表达，长时间却能严重抑制AMA基因的表达，随着试验的进行抑制效果愈明显。结果表明，不同剂量SW能在不同时间、不同程度地影响小白鼠肝脏AMA基因的转录表达。关键词：苦马豆素；a一甘露糖苷酶基因；实时荧光定量PCR中图分类号：Q786文

3、献标识码：A文章编号：167卜7236(2014)02—0050—04小花棘豆(OxytropisglabraDC．)俗称醉马100只，雌雄各半，购自内蒙古大学实验动物中心。草，是豆科棘豆属(Oxytropis)多年生草本植物，是1．1．2主要试剂和仪器SW由内蒙古农业大学疯草的一种，全草有毒(王帅等，2012)。疯草(LOCO—兽医学院临床兽医学毒理实验室从小花棘豆中提weed)是豆科棘豆属和黄芪属(Astragalas)2属中取，纯度为99．7％；动物组织总RNA提取试剂盒购能引起动物以慢性神经机

4、能障碍、机体消瘦为中毒自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒及特性的有毒植物总称(卢围等，2011)。苦马豆素所用的工具酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；(swainsonine，SW)是疯草的主要毒性成分(MolySYBRGreen1IRealtimePCR荧光染料购自北京全neux等，1982)，属于多羟基ⅡjI哚里西啶类生物碱，式金生物技术有限公司。EXI808全自动酶标仪购是一种极强的Q一甘露糖苷酶(a—mannosidase，自Bio—Tek公司；生物安全柜购自Thermo公司；AM

5、A)竞争抑制剂，可使机体甘露糖的代谢发生异PCR仪购自Eppendorf公司；SyngeneG：BOX凝胶常(Wiedrok等，2007)，大量蓄积在细胞内而导致细成像仪购自Syngene公司；Bio—RadIQ5实时定量胞空泡变性，造成器官组织损害和功能障碍，并最终PCR扩增仪购自伯乐公司；HC一2518高速离心机购导致细胞死亡(Cikog等，2009)。另外，Sw也能抑自安徽某科学仪器有限公司。制高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ的活性，导致糖蛋白合成1．2方法的改变。1．2．1试验动物分组及处理小白鼠随机分为

6、4本试验选用SW通过实时荧光定量PCR对小个试验组及1个对照组，分别为A1(低剂量)、A2白鼠肝脏中AMA基因的相对表达量进行研究，探(中剂量)、A3(中剂量)、A4(高剂量)和D组，每组讨小花棘豆的中毒机理。20只。将SW用去离子水稀释成不同浓度，试验组1材料与方法A1～A4胃内灌服的SW溶液浓度分别为0．02、1．1材料0．1、0．3和0．6mg／mL，对照组胃内灌服去离子水。1．1．1试验动物体重(20±2)g的昆明系小白鼠将小白鼠适应性饲养1周后，空腹称重，按0．01mL／g体重胃内灌服相应浓

7、度的SW溶液或去离子收稿日期：2o13—07—11水，自由饮水。每隔3d称体重以调整灌服SW溶作者简介：张建军(1985一)，男，山东人，硕士，研究方向：动物中液的量。于试验第7、14、21、28和35天每组分别随毒病。机抽取4只小白鼠断头处死，于冰上迅速分离肝脏通信作者：韩敏(1954一)，男，教授，从事动物营养代谢病和中毒病的研究。E—mail：nmhanmin@126．corn组织，置于液氮中保存，所有解剖工具及冻存管均预基金项目：内蒙古自然科学基金(2012MS0404)。先用DEPC水处理。

8、中国畜牧兽医2014年第41卷第2期生物技术·51·1．2．2引物设计与合成据GenBank中小白鼠Designer软件设计引物。引物由宝生物工程(大连)AMA及~-actin基因的核苷酸序列，采用Beacon有限公司合成。引物信息见表1。表1引物信息1．2．3总RNA提取和cDNA的合成按动物组2结果与分析织总RNA提取试剂盒(离心柱型)说明书提取各组2．1RNA纯度及完整性测定各组肝脏组织提取小白鼠肝脏总RNA。取5LRNA提取液加的RNAD脚／D。