豌豆肌动蛋白异型体PEAc3基因的克隆及生物信息学分析-论文.pdf

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1、2012，VoI．29No．1化学与生物互程Chemistry&Bioengineeringdoi：10．3969／]．issn．1672—5425．2012．01．013豌豆肌动蛋白异型体PEAc3基因的克隆及生物信息学分析张少斌，王粲，刘慧，刘曦(沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110866)摘要：根据NCBI文库中检索到的序列，采用RT_PcR技术克隆了豌豆肌动蛋白异型体PEAc3完整编码区的cD—NA序列，基因全长1134bp，开放阅读框编码377个氨基酸。氨基酸序列分析表明，该基因的编码蛋白PEAc3为可溶性蛋白，分子量41668．7Da，没有信号

2、肽部分，呈酸性，PEAc3包括ACTINs_1(编号：PS00406)、ACTINS_ACT—uKE(编号：PS0l132)以及ACTINs2(编号：PS00432)3组肌动蛋白序列指纹图谱(Signature)。序列同源性分析表明，PEAc3与其它上百种植物肌动蛋白同源性高达89．O7。并讨论了模体中可结合配体的位点与功能之间的联系。关键词：豌豆肌动蛋白异型体；多序列比对；序列指纹图谱中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1672—5425(2012)01～0050。_04肌动蛋白(Actin)是真核生物中普遍存在的一种1实验古老的蛋白质，是构成细胞骨架的

3、主要成分，也是维持细胞形态结构及生长发育的基础。Actin最早在动物1．1材料及主要试剂骨骼肌细胞中被发现，我国科学家阎隆飞等口首次证豌豆(Pisumsativum．)卷须采自温室培养的豌豆明了植物Actin的存在。在细胞中肌动蛋白结合蛋白植株；大肠杆菌DH5a、质粒pET一30，实验室保存；克(Actinbindingproteins，ABPs)调控下，Aetin微丝的隆载体pGEM—Teasy，Promega公司；dNTP、Taq聚长度、极性、稳定性和三维结构处于动态变化之中，并合酶、胶回收试剂盒、TRizol，Takara公司；其它试剂将Actin纤维与细胞

4、浆和细胞膜的其它成分相连接，均为进口或国产分析纯。从而调节Actin的理化状态，藉以完成多种细胞功能，引物合成及测序由上海生工生物技术有限公司完包括细胞分裂、内吞作用E、细胞信号传导、重力成。感应[6]、细胞顶端生长[8]、细胞器运动口等。1．2肌动蛋白基因克隆与测序近年来，人们陆续从高等动植物体中克隆了Actin总RNA提取采用TRizol法，0．1g卷须加入1基因，并分离纯化出许多肌动蛋白异型体。通过对拟mLTRizol。参照张少斌等的RT-PCR方法，首先南芥Actin基因家族的系统发育分析，将它们分成营将mRNA反转录合成cDNA。根据NCBI检索到的养型

5、肌动蛋白(Vegetativeactin)和生殖型肌动蛋白PEAc3序列，设计引物如下：(Reproductiveactin)，其表达具有明显的组织特异性，上游：GCGAATTCATGGCAGAATCCGA—并且在大多数组织和器官中往往同时大量表达着两种AGATAT(EcoRI)；下游：GCGGTACCGAAG—以上的肌动蛋白异型体口，且不同肌动蛋自异型体的CATTTCCTGTGTAC(KpnI)。表达具有时空的特异性，发挥作用也不尽相同。反应条件为：95℃热变性5min，94℃30S，59℃作者在此采用RT-PCR技术克隆了豌豆肌动蛋30S，72℃2min，共3

6、5个循环，72℃下延伸10min，白异型体PEAc3完整编码区的cDNA序列，并作了4℃保存。生物信息学分析，推断了编码蛋白的结构，拟为进一步PCR反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳，紫外灯研究其结构与其生物学作用之间的联系奠定基础。下观察结果。参照DNA胶回收纯化试剂盒说明，将基金项目：植物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题资助项目(PPB08003)收稿日期：2011—1O—O8作者简介：张少斌(1973一)，男，辽宁彰武人，副教授，研究方向：蛋白质结构与功能，E-mail：zsb20022001@yahoo．corn．cn。张少斌等：豌豆肌动蛋白异型体PEA

7、c3基因的克隆及生物信息学分析／2o12年啊1期——一————————————MAESEDIOPIVCDNGTGMVKA(AGDDAPRAVFPSIVGRPRHTGVMVGPCR扩增产物的特异性片段进行胶回收，与pGEM—TMGOKDAYVGDEAOSKRGILTLKYPIEHGIVSNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKAN惩KMTQIMFETFNTPAMYVAIOAVLSIyeasy载体连接，转化，经蓝白斑筛选，随机挑取白斑进ASGRTTGIVLDSGDGVSHTVPIYBGYALPHAILRLDLAGRDLTDGLMⅪTER

8、GYTFT