细胞生物学实验课.ppt

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1、细胞工程实验课程组成员：杨慈清、李虎、王红霞、许重洁办公电话：3029114新乡医学院生命科学实验教学中心实验二细胞融合技术与染色体提前凝集标本制备实验一动物细胞的培养实验三小鼠MEF饲养层的制备实验五原生质体的分离、纯化和活力鉴定实验四MS培养基的配制和愈伤组织诱导目录实验一动物细胞的培养一、实验目的掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作。了解化学消毒法的使用方法。了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况及细胞增殖动力学测定的方法。二、实验原理细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实

2、验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。显微镜下的培养细胞三、实验方法1、玻璃器材的清洗处理方法2、塑料器材的清洗处理方法3、橡皮器材的清洗处理方法4、金属器材的清洗处理方法5、细胞的消化传代方法方法1、玻璃器材的清洗处理方法清洁液浸泡或用2%磷酸三钠或洁消精浸泡过夜自来水冲10次培养瓶再用三蒸水浸泡过夜晾干包装灭菌单蒸水洗2次晾干备用备用刷洗浸

3、泡2、塑料器材的清洗处理方法用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜（单用或交叉处理）水洗10次单蒸水2次紫外线或辐射灭菌备用三蒸水浸泡过夜晾干刷洗浸泡3、橡皮器材的清洗处理方法5%NaOH煮10′～20′水洗4%盐酸煮10′～20′单蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干备用水洗8~10次刷洗浸泡金属器材的清洗处理方法纸擦去表面的油脂洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟水洗95%酒精纱布擦干包装灭菌4、金属器材的清洗处理方法吸除或倒掉旧培养液加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%

4、EDTA或混合液）肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液继续作用2～3分钟显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化5、细胞的消化传代方法加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打计数板计数分瓶培养细胞的消化传代方法生长细胞形态四、作业与思考1．简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。2．细胞培养获得成功的关键要素是什么?3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。4．绘制细胞生长曲线图。5．绘制细胞分裂指数图。实验二细胞融合技术与染色体提前凝集标本制备一、实验目的通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备

5、原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。二、实验原理M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染色体称提前凝集的染色体(PrematurelyCondensedChromosome，PCC)。三、实验方法1、细胞融合方法2、PCC诱导和观察收集1瓶M期细胞、消化一瓶贴壁细胞混合离心用Hank’s液洗1次离心弃上清（吸干）轻弹使细胞分散90s后1、细

6、胞融合方法37℃滴加50％PEG0.5ml（12滴）加入2ml1640（含10％血清）加一滴秋水仙素（10μg／ml）分别在5min、15min、20min观察细胞融合加入5ml1640洗一次（不要吹打）离心细胞融合90分钟后离心弃上清加入0.075mol/lKCl8ml混匀37℃25分钟加入1ml固定液混匀离心弃上清2、PCC诱导和观察加7ml固定液固定20min离心弃上清加0.5ml固定液滴片（冰、高、烤）Giemsa染色12min水冲、晾干、镜检四、作业与思考根据PCC图像的观察，试说明对于理解细胞周期和DNA复制有

7、什么启示?简述细胞融合的原理。PCC实验的主要意义是什么？实验三小鼠MEF饲养层的制备一、实验目的1.掌握常用饲养层的制备原理和方法。2.巩固细胞培养相关的的技术。二、实验原理胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES）的体外培养要求增殖的同时保持未分化的状态，因此，我们要进行体外培养胚胎干细胞，必须环境中满足两个条件：细胞生长因子和分化抑制因子。体外培养的成纤维细胞可以分泌细胞生长因子和分化抑制因子，前者可以促进ES细胞的增值，后者可以有效的抑制ES的自主分化。目前，可以用来制作饲养层的细胞有多种，其中原代小

8、鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast,MEF）取材方便，易于铺层，分泌能力强而成为ES细胞首选的饲养层细胞。将原代培养的MEF细胞进行传代，多为3－6代，这样不仅可以使得MEF细胞的纯度较高，而且生长状态也很好。在制备饲养层前将MEF细胞用丝裂霉素C或射线照射预处理，抑制D