奎宁酸香豆酰转移酶（LjHCT）基因克隆与序列分析-论文.pdf

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1、2014第十六卷第二期*Vo1．16No．2金银花莽草酸／奎宁酸香豆酰转移酶(LjHCT)．&@克隆与序列分析六何柳，徐晓兰，王振中，毕宇安，萧伟，罗红梅，孙超(1．中国医学科学院北京协和医学院／药用植物研究所北京100193；2．江苏康缘药业股份有限公司／中药制药过程新技术国家重点实验室连云港222001)摘要：莽草酸／奎宁酸香豆酰转移酶(HCT)是金银花中绿原酸合成途径的关键酶。本研究利用已经获得的金银花(LoniceraaponicaThunb．)大量表达序列标签(EST)数据，通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得8条可能的HCT基因cDNA全长序

2、列。通过序列相似性比较、蛋白质理化性质和保守结构域分析确定其中1个基因为金银花HCT(LjHCT)基因。该基因全长1275个碱基，蛋白质分子量约为47kDa，为进一步研究HCT在绿原酸合成过程中的功能奠定基础。关键词：莽草酸／奎宁酸香豆酰转移酶金银花绿原酸基因克隆与序列doi：10．1l842／wst．2014．02．009中图分类号：R284．1文献标识码：A金银花(LoniceraaponicaThunb．)为川续断目酶。苯丙氨酸经过多步酶催化反应后生成木质素、忍冬科植物，是我国最常用的中草药之一。它的主黄酮类物质、细胞壁组分等重要产物，是植物次生要活性成分绿原

3、酸，是抗菌、止血、消炎、利胆、增代谢合成主要途径之一[4I。这条途径的产物与植物高白血球、抗病毒药物的重要原料，具有肾上腺素抗病虫害，抗uV、低温等逆境胁迫紧密相关，在金类似的作用；绿原酸对人有致敏作用，吸人含有绿银花中绿原酸就是通过苯丙烷途径合成。由于HCT原酸的植物尘埃后，可发生气喘、皮炎等，但食人的催化底物之一对香豆酰辅酶A处于多个下游合后可经小肠分泌物作用，变为无致敏性物质；蔬成途径的分支点，所以，HCT酶活直接影响到下游菜、水果中的多酚类如绿原酸、咖啡酸等可通过抑产物的种类和数量。有研究发现如果降低植物中制活化酶来抑制致癌物黄曲霉毒素B和苯并芘的HCT基因

4、的表达量，那么对香豆酰辅酶A将会更多变异原性；它还可通过降低致癌物的利用率及其的被查尔酮合酶催化生成黄酮类物质，而木质素的在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的效果；增强机合成可能就会减少f5]。体免疫作用。HCT属于BAHD酰基转移酶超家族l6i，最早是香豆酰辅酶A：莽草酸／奎宁酸香豆酰转移酶从烟草中分离出来的l7l，近年来在多个物种中都有(Hydr(】xyeinnamoy1一CoA：Shikimate／QuinateHydrox—报道，如拟南芥『8_、朝鲜蓟[9,10】、杨树l1】]、茶树【l2]等。它ycinnamoyltransferase，HCT)是植物苯丙烷途

5、径中催可以把对香豆酰基辅酶A和咖啡酰辅酶A的酰基化对香豆酰辅酶A与莽草酸或奎宁酸反应的关键转移给莽草酸酯基和奎宁酸酯基，以莽草酸为底物时HCT的酶活效率更高_6】。而且研究发现HCT还可收稿日期：2014—02—07修回日期：2014—02—18-h"国家自然科学基金委青年基金项目(81102761)：基于赤芝与紫芝全基因组比较阐明灵芝三萜类物质合成途径，负责人：何柳；国家自然科学基金委面上基金项目(81273485)：灵芝三萜的生物合成途径解析及其异源生物合成研究，负责人：孙超。★★通讯作者：萧伟，本刊编委，研究员级高级工程师，主要研究方向：中药新剂型的研究与开发

6、；孙超，副研究员，主要研究方向：中药资源学。263(WorldSconceandTechnology／ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica]世界科学技术一中医药现代化★专题讨论：中药材研究与开发以逆向催化绿原酸生成咖啡酰辅酶A，这样可能会PCR仪9700(ABI，美国)，凝胶成像系统(BIO—抑制绿原酸积累而生成更多的木质素，所以HCT不RAD，美国)，高压蒸汽灭菌锅(Sanyo)，一80。c超但控制着次生代谢物的合成，还可能在次生代谢物低温冰箱(Thermo)，DYY一8C型电泳仪(北京

7、六一数量平衡中发挥重要作用【6】。通过RNAi技术将拟南电泳厂)，制冰机(Scotsman)，高速冷冻离心机芥中HCT基因沉默后，得到的拟南芥植株矮小不LEGENDMICRO17R(Thermo，America)，GILSON育，而且木质素成分发生变化，其中S型木质素的和EPPENDORF移液器等分子生物实验室常规仪匮乏与HCT的缺失相关fl31。在烟草中，利用酶免疫器等。定位的方法，通过激光共聚焦显微镜观察到在烟草1．2方法维管细胞中，木质素组分类别与HCT的蛋白量有明1．2．1金银花叶片和花蕾总RNA提取和cDNA反显相关性【。这些结果表明HCT在植物苯丙烷