高糖环境对内皮祖细胞成骨分化能力及其机制探讨.doc

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1、高糖环境对内皮祖细胞成骨分化能力及其机制探讨［摘要］目的观察高糖环境对内皮祖细胞成骨分化能力的影响，并对其机制进行探讨分析。方法釆用密度梯度离心法分离及培养取得EPCs（内皮祖细胞），通过观察3组（对照组20ug/mL.观察组60ug/mL.实验组80yg/mL）不同浓度高糖干预液对内皮祖细胞迁移、增殖及凋亡等功能产生的影响，并对成骨钙化基因进行相关检测，进而观察高糖环境对内皮祖细胞成骨分化能力所产生的影响。结果与对照组比较，观察组及实验组可明显抑制内皮祖细胞的迁移及增殖功能，加速其凋亡，可明显促进内皮祖细胞成骨分化，且观察实验组变化最为显著（P<0.05）o结论高糖环境能明显抑制内皮

2、祖细胞的迁移及增殖能力，加速英凋亡，可明显促进内皮祖细胞成骨分化；对深入研究糖尿病血管钙化机制有积极作用，为临床干预治疗提供新相关依据。［关键词］高糖环境；内皮祖细胞；成骨分化；糖尿病［中图分类号］R587.1［文献标识码］A［文章编号］1672-4062（2016）10（b）-0065-02近年来，随着我国生活水平的不断提高，糖尿病发病率呈明显上升趋势，而糖尿病致残及致死主要因素为糖尿病大血管并发症。内皮组细胞在血管内皮细胞的前端，它対于血管的重生再造和血管皮肤的复原都有着-I•分重要的意义，而高糖环境可导致内皮祖细胞数量急剧减少及迁移功能出现障碍，糖尿病大血管病变及并发症的出现与内

3、皮祖细胞数量及功能出现紊乱冇着密切联系；而血管钙化是糖尿病病人最容易出现的症状，它是主血管被破坏的罪魁祸首。学者讲过研究指出，血管钙化涉及到多种的细胞，病变过程极其复杂，但是它与人类骨骼的成长过程差不多，它是一种可以掌控的、自发的生物发展程序。血管钙化主要冇两种病变情况：一个是动脉内膜呈现粥状的变硬，它的病理和脂质代谢紊乱极其类似，同时伴有发炎的情况。与此同时，内皮细胞遭到破坏，无法自动修复和免疫病毒,遭到破坏的损坏细胞会沉积于血管底部，最终导致组织贫血；另外一个是动脉屮膜呈现线状的变硬，它在脂质沉积的部位和没有炎症的细胞软浸区极易发生，这些沉积物最后会堵塞胶原蛋白的末端，它和平滑肌的

4、分离有很大的关系。该文通过观察高糖环境对内皮祖细胞成骨分化能力的影响，并对其机制进行探讨分析，现报道如下。1资料与方法1.1一般资料CML-BSA购于美国Cell-Biolabs公司(货号STA-314),该产品不能直接使用，需耍用PBS将其降低稀释。美国公司HyClones出出品的的DMEM/F12；美国公司G1BC0出品的胎牛的血清(FetalCalfSerum,FBS)；由美国赛摩科技公司(ThermoFisherScientific)出品的型号HERACELL150i的C02类细胞的繁殖箱；流式细胞仪：美国BD公司，型号FACSCaliber；酶标仪:美国BioTek公司，型号

5、ELx800NB；倒置显微镜:日本OLYMPUS公司，型号IX71-A12FL/PH。1.2方法首先需要对一个健康的成人核细胞进行分解，所用的方法为EPSs分解繁殖不同密度离心法。经过此方法后，将冇促进血管内皮发育的因子以及碱性纤维发育因子和10%的幼牛血清放入M199培养基进行放置，3d之后除去没有贴壁的细胞，至于贴壁的细胞，将英继续添加生长银子，每3d重新放置，等到第八天的吋候贴壁细胞被消化吸收殆尽，这时使用激光式共聚焦显微镜额细胞仪进行分析。1.3分组为对比、观察、实验（对比组20Ug/mL＞观察组60Ug/mL.实验组80Ug/mL）,每组进行实验/d。1.4衡量检测和所用方式

6、首先在EPCs96孔式的能力检测板上添加100微毫升两千个没有血清的细胞培养基，在经过1d的同步之后，对他们进行不同的处理，每个小孔添加10uL升LCCK-8液体继续繁殖2h,酶标仪450nm来检测对光感应程度，最后根据小孔和对比孔的对光感应程度分析出EPCs的增加数量。每一个小组必须做五次反复尝试。然后EPCs死亡能力相关测验将处理后的细胞加入195uLAnnexinV-FITC结合液（IX）重悬细胞。加入5uLAnnexinV-FITC,轻轻混匀。室温避光孵育10min,1000g离心5min,弃上清，加入190uLAn-nexinV-FITC组合水微微重新悬挂细胞。加入10UmL

7、碘化丙噪染色液体，慢慢地把他们摇匀，在低温中清晰尽量躲开阳光。随即进行流式细胞仪的检查。每组反复重新做五次。接下來是EPCs发育成功的骨头基因探测，该探测采用SYBRGreenl嵌合荧光法在illumna公司的EcoTM-Real.TimePCR仪上进行Real.TimePCR实验，所使用的试剂盒为SYBRPremixExTaqTT(T1iRNaseHPlus,TaKaRacode：DRR820),反应条件为预见变化95度30s、PCR对应40