原花青素对高糖环境下大鼠内皮祖细胞vegfr-2及其传导通路的影响

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1、目录1原花青素对高糖环境下大鼠内皮祖细胞VEGFR．2及其传导通路的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．4材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．5结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．231．6讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯321．7结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯411．8参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯421．9

2、英汉缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯472致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯483氧化应激产物对内皮祖细胞的影响(综述)．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50原花青素对高糖环境下大鼠内皮祖细胞VEGFR．2及其传导通路的影响摘要目的：全世界糖尿病的快速增长趋势使21世纪人类健康问题面临严峻的挑战。糖尿病患者的增长数量超过预期。在2007年，全世界2．46亿(约6％)的人群患病，估计在2025

3、年这个数值将达到3．8亿，约占全世界人口总数的7．3％。与此同时，预计有接近3．08亿的人群有糖耐量异常，这是导致2型糖尿病的高危因素，糖尿病(DiabetesMellitus，DM、)是一种以高血糖，胰岛素缺乏导致的糖耐量异常和／或胰岛功能下降为特征的代谢紊乱性疾病。糖尿病大血管病变一直是患者致残致死的首要原因，30％～40％的患者在发病10年后至少会发生一种血管并发症。大量研究显示：DM血管并发症与内皮细胞氧化应激密切相关，而部分内皮细胞起源于内皮祖细胞(主要分布于骨髓)。大量资料表明，糖尿病患者体内高糖环境对其内皮细胞的功能有较

4、大的影响，与此同时，外周血中内皮祖细胞的数量也急剧下降，这提示内皮祖细胞的功能和数量与糖尿病血管并发症的发生有很大相关性。原花青素及其低聚产物是存在于大多数植物中的一种抗氧化剂，在浆果内植物中含量远远超过其它植物数倍。目前为止，葡萄籽中花青素的含量是最为丰富的。本文主要研究原花青素及其低聚物在抗氧化应激方面对EPCs的保护作用，探讨高糖环境下原花青素对体外培养的大鼠内皮祖细胞的vEGFR一2及其下游相关通路的影响作用。方法：将SD大鼠脱颈处死，用75％酒精浸泡20分钟，在超净台下进行股骨和胫骨的无菌分离，用无菌的含l％肝素的PBS液冲

5、洗骨髓腔，直至冲洗液呈无色透明状，收集所有冲洗液，并进行高速离心，移去上清液，收集离心后试管底的细胞，采用Fic01l密度梯度离心法分离大鼠骨髓单核细胞；将分离出的单核细胞接种于6孔板中，分别于3d、7d后进行换液及在倒置显微镜下观察细胞形态变化。采用FITC—UEA．1和DiI—acLDL双吞法鉴定EPCs。分别检测正常糖浓度组(5．5mm01／L+25mmol／L甘露醇)培养和高糖浓度组(30mm01／L)培养的EPCs增殖和氧化应激产物产生情况，再通过在不同原花青素浓度下检测各时间点EPCs增殖的方法，筛选出最佳原花青素浓度(3

6、0肛g／m1)；分别用Mat“gel基质胶检测正常糖浓度+30岭／ml0PC、正常糖浓度组、HG+30¨g／mlOPC、HG组EPCs成管能力；最后在1d、3d、5d、7d分别检测正常糖浓度+30p∥ml0PC组、正常糖浓度组、高糖浓度+30吲m10PC组、高糖浓度组的EPCs的MDA值以及VEGFR．2、AKT、IKB．a和NF．KB蛋白的相对表达量。结果：接种在6孔板中的细胞3d后，大部分呈圆形，细胞透亮，并逐渐开始贴壁，继续培养7d后，可见细胞发生形态变化，大部分细胞呈现梭形形态，最终呈现出“鹅卵石”形态分布。EPCs经过DiI

7、—ac—LDL及FITC—UEA．1处理后，在激光共聚焦显微镜下观察细胞显色，绿色荧光为经FITC．UEA．1处理后EPCs，红色荧光为经DiI-ac—LDL处理后EPCs，蓝色荧光为核染色，双染阳性鉴定为正在分化的EPCs。随时间推移，高糖浓度组中EPCs细胞凋亡和氧化应激产物均较正常糖浓度组逐渐增多(PO．05)，HG+0PC组成管数目较HG组明显增多(P

8、KT、IKB—a和NF．KB蛋白的相对表达量没有显著影响(P>O．05)，而在高糖环境下可以明显降低氧化应激产物的生成及上调VEGFR一2、AKT和NF．1出蛋白相对表达量(P