高糖对血管内皮细胞短期作用机制探讨-(8396)

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1、10．5×TBE液Tris．HCl0．89mol／L硼酸0．89mol／LEDTAO．025mol／LpH8．3，高压灭菌，应用时稀释至O．5xTBE液。11．6×RNA电泳负载液溴酚蓝0．25％蔗糖40％12．2％琼脂糖凝胶称取0．79琼脂糖，加入0．5XTBE液35ml，煮沸使琼脂糖完全溶解，冷却至60'C，加入10ul0．5mg／mlEB，补足水分至35ml。13．10×Ⅳ田OS：MOPS4．1889NaAe‘3H200．689ED呵A·2Na0．88969加双蒸水溶解至100ml，调pn至7．014．Fura-2／AM(

2、2-[6．双乙酸基-5-(2一双乙酸氨基)一5-甲苯氧乙氧基】_2．苯骈呋喃．5一恶唑羟酸五钾盐)O．5mg，ura-2／AM溶解于5001al二甲基亚砜中，分装后-20℃保存。15．10％TritonXq00(辛基苯基聚氧乙烯醚)取1mgTritonX-100溶解于10ml双蒸水中，充分溶解后分装．4℃保存。16．EGTA(乙二-醇双(．氨基乙基)醚四乙酸)称取1．909，用3mmol／L的Tris溶液配制成10ml(0．5mol／L)，分装，412保存。四、注意事项1．所有溶液都用双蒸水或三蒸水配制。2．所有涉及RNA的实验

3、，尤其在RNA抽提过程中所使用的器皿和溶液均需避免受核糖核酸酶污染。全部器皿和溶液使用前进行高压灭菌或过滤除菌，实验过程中带手套进行操作。3．电泳槽使用前需经O．I％SDS浸泡过夜，双蒸水充分冲洗，晾干后使用。实验方法一、细胞培养和处理1．人脐带静脉内皮绷胞原代培养参照史文举等⋯的方法，取新鲜长约35cm脐带一根放入瓷盘中。于脐带一端找到脐静脉口，插入橡皮管并固定，用注射器抽取生理盐水反复冲洗至无血，再吸50ml37"CPBS冲洗一次。然后灌入15ml0．5％胰酶，用止血钳夹闭脐带两端，放入37℃水浴中消化20分钟。放出酶液于离

4、心管中，加入含20％d、牛血清的199培养液终止反应，用Hanks液冲洗两次并收集于离心管中，1000rpm×10分钟，弃上清。Hanks液洗涤细胞两次，最后加入3ml含20％小牛血清的199培养液悬浮细胞。取9滴细胞悬液于离心管中，滴入1滴0．4％胎盼蓝，混匀，静置2分钟，滴一滴染色的细胞悬液充满记数板和盖玻片间隙，然后在显微镜下记数。细胞数／ml=4大格细胞总数÷4X10'×稀释倍数【2]．细胞记数为106并按种于25ml或50ml培养瓶中。放入37℃5％C02孵箱中培养。第二天换全液，以后每3天换一次培养液，待细胞铺满瓶后

5、即可进行下一步实验。2．倒置显徽髓下鉴定细胞[11细胞24小时完全贴壁，早期呈小多角形，以后逐渐变成短梭形，呈鱼贯状排列。铺满瓶时呈铺路石状“卵石征象”，单层无堆叠，出现接触性生长抑制，胞浆丰富，核圆形或椭圆形。3．原代脐带尊脉内皮细胞处理待细胞铺满至2／3瓶以上时，加无血清培养基培养48小时后换高浓度D．葡萄糖处理。实验分为两组：(1)正常对照组：用5．56mmol／LD．葡萄糖处理6、12和24小时；(2)高糖组：用11．11mmol／L、16．67mmol／L和33．33mmol／LD．葡萄糖处理24小时，16．67mmo

6、l／LD．葡萄糖处理6、12和24小时。培养6、12和24小时后，收集培养液(．20℃贮藏)用于测定Ⅳ型胶原和层粘连蛋白。用0．02％EDTAlml和O．125％胰酶lml消化细胞10--20秒(贴壁细胞变圆)，倒出消化液。加入含20％小牛血清的199培养液5ml终止反应，用弯头吸管吹打细胞至脱落。吸出细胞悬液，1000rpmX10分钟，弃上清，用含0．2％小牛血清白蛋白的D-Hanks液洗涤细胞两次后测定细胞内【Ca27i或用PBS洗涤细胞两次后检铡TGF—p基因表达。二、血管内皮细胞TGF-[B基因表达的检涓1_细胞总RNA

7、的提取啪8吸细胞悬液(细胞数约3×107)入Eppendorf管

8、r4，500rpm×5rain4"CJr巍篙取上清，加入2001al变性液200pl饱和酚2001．d氯仿，异戊醇—，v=24，1)混匀Jr黧醺I弃异丙醇士沉淀加入lml95％7--,醇14，000rpmX10min4"C土真空干燥沉淀2．R．NA样品的定量和电泳鉴定取151alDEPC处理双蒸水溶解RNA沉淀，取5“l在紫外分光光度计上分别测定其260nm和280nmOD值。RNA纯度：OD26c／OD280=1．89，RNA浓度=1．71ag／ixlⅢ。RNA

9、电泳：用水和I％SDS洗净电泳槽和梳子，纯乙醇擦洗干净。3％H202浸泡2小时，再用DEPC处理的水清洗。把O．359琼脂糖放人3．5ml10xMOPS溶液，加DEPC处理双蒸水至35ml。在沸水中放置5分钟至凝胶充分溶解，冷却至50X2左右，加lOlal溴化乙