产α-半乳糖苷酶菌株的筛选、酶学特性和固定化研究.pdf

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1、第35卷第3期东北电力大学学报Vo1．35．No．32015年6月JournalOfNortheastDianliUniversityJun．，2015文章编号：1005-2992(2015)03-0077—05产o(一半乳糖苷酶菌株的筛选、酶学特性和固定化研究赵睛潇，魏群(东jE电力大学化学工程学院，吉林吉林132012)摘要：为解决目前工业用一半乳糖苷酶耗能大、成本高的难题，研究泡菜汁中筛选出产一半乳糖苷酶的菌株，而后对其进行紫外诱变和亚硝酸钠进一步诱变，并在不同温度和不同pH下测定一半乳糖苷酶酶活力。

2、结果表明：获得一株酶活高达36．9U／mL的0【一半乳糖苷酶菌株，该菌株所产O／．一半乳糖苷酶的最适反应温度为50℃，最适pH为5．5。利用4％海藻酸钠做为固定剂对一半乳糖苷酶进行固定化，可以使酶活保持在70％左右，此d一半乳糖苷酶高产菌株的发现及其酶学特性的研究为一半乳糖苷酶的工业化应用奠定了基础。关键词：一半乳糖苷酶；选育；固定化中图分类号：Q93-33文献标识码：A仅一半乳糖苷酶也称蜜二糖酶，属于外切糖苷酶类，加水可以分解蜜二糖11。一半乳糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物中，不同来源的仅一半乳糖苷酶

3、其理化特性相差明显。以植物(咖啡、车前草、蚕豆、西瓜)取材的一半乳糖苷酶研究得较多。在各种哺乳动物组织匀浆中也存在仅一半乳糖苷酶，以人和鼠的甲状腺、。肾脏和脾脏的酶活最高。微生物来源的一半乳糖苷酶研究的也比较深入。特别是丝状真菌一半乳糖苷酶由于其合适的pH、良好的稳定性、细胞外分泌和表达量较高的特点而成为研究的热点。但当前国内外学者对于不同来源仪一半乳糖苷酶的研究发现，无论是从动植物、微生物或者采用其它技术手段获得的一半乳糖苷酶均存在着如下两个问题：一是该酶的提取工艺复杂，耗费大量生产成本，为该酶在工业上大

4、量应用的一个弊端；二是普遍酶活性不高，固定化后活力进一步下降，导致重复使用的困难，不能满足工业化生产中特殊要求J。本实验试图筛选一株具有高酶活的产一半乳糖苷酶菌株并对其固定化研究，以求解决这一问题。1材料与方法1．1实验材料1．1．1主要试剂泡菜汁(市售)、对硝基苯a-D-半乳糖苷和对硝基酚、5一溴-4-氯-3一吲哚-B-D-半乳糖苷(X-a-Ga1)、棉子糖。1．1．2主要仪器离心机、恒温培养箱、摇床、数显恒温水浴锅、灭菌锅、紫外诱变箱、循环水多用真空泵。1．1．3培养基初筛培养基：蛋白胨10g、牛肉膏1

5、0g、酵母提取物5g、磷酸二氢钾2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠5g、收稿日期：2014-0710作者简介：赵晴潇(1980一)，女，吉林省吉林市人，东北电力大学化学工程学院实验教师，主要研究方向：破骨细胞分化发育78东北电力大学学报第35卷葡萄糖20g、七水硫酸镁0．58g、四水硫酸锰0．25g、吐温800mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL。1mLX—OL-Gal／L溶液(每800毫升添加5O毫克指示剂)。发酵培养基：初筛培养基中2％的葡萄糖用棉子糖取代。1．2分析方法1．2．1产0【一半乳糖苷酶菌株的筛选

6、(1)初筛在无菌条件下，用无菌双蒸水对泡菜汁进行逐级梯度稀释(10一一10)，吸取10～、10及10三个梯度各100tzL溶液分别涂布在初筛固体培养基上，37℃下培养3-4d，使菌落变成蓝色的菌落，挑取单菌落进行液体发酵。(2)发酵将初筛的菌种接种于发酵培养基中，用对硝基酚法测定酶活，筛选出酶活力最大的菌株作为目标菌株J。(3)紫外线诱变将制备好的菌悬液放置在紫外诱变箱中，利用15W紫外灯，照射距离25cm，设置照射时间分别为0．5min、1．0min、1．5min、2．0min、2．5min、3min6个

7、梯度处理。(4)亚硝酸钠诱变将制备好的菌悬液用亚硝酸钠及醋酸分别处理2min、4min、6min、8min、10min，加入pH8．6的NaHPO溶液终止反应。以亚硝酸钠处理6min的菌株A为实验菌种，在斜面上连续传代5代。1．2．2对硝基酚法测一半乳糖苷酶酶活力利用对硝基酚法测仅一半乳糖苷酶酶活力]。1．2．3酶学性质研究(1)仪一半乳糖苷酶的最适pH将一半乳糖苷酶液在pH4．5一pH7．5下进行酶促反应以测定其最适pH值。以pNPG为底物，37℃下反应15min测定酶活。(2)o【一半乳糖苷酶的最适温度

8、将仅一半乳糖苷酶液在35℃一65℃下进行酶促反应以测定其最适温度，以pNPG为底物，pH5．5反应15min狈4定酶活。(3)热稳定性以pNPG为底物，pH5．5，温度分别为30℃、4OcI=、50cI=、6O℃、7O℃、80℃的条件下保温1h，测定保温后的残余酶活性。(4)金属离子对一半乳糖苷酶活力的影响用浓度为0．01mol／1的金属离子Ca、K、Fe¨、Cu、EDTA分别与酶液以1：1的比例进行混合，37℃