人乳中蛋白质的组成分析

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1、第27卷第9期应用化学Vo1．27No．92010年9月CHINESEJOURNAL0FAPPLIEDCHEMISTRYSep．2010人乳中蛋白质的组成分析石磊刘晓梅程舸王韶(吉林大学公共卫生学院长春130021)摘要在对人乳样品分离与纯化的基础上，采用“BottomUp”并结合高效液相色谱(HPLC)和配有纳米喷雾(Nano．spray)技术的高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT．ICR．MS)，将人乳各部分蛋白质样品酶解成多肽片段。利用碰撞活化解离(CAD)和电子捕获解离(ECD)2种解离方式断裂机理的互补性规律，借助Mascot软件数据库，快速分析了人乳样品中乳脂部分、乳清部分

2、和乳粒部分所含主要蛋白质的组成。人乳样品各部分的共同物性是均含有多种角蛋白、乳白蛋白、乳铁蛋白，但含量和种类各有不同，这既表明了人乳特殊的营养成分，又从另一角度显示出人乳各个部分营养价值的差异。关键词人乳，蛋白质，组成中图分类号：0655文献标识码：A文章编号：1000-0518(2010)09-1099-06DOI：10．3724／SP．J．1095．2010．90852人乳蛋白分乳脂蛋白、乳清蛋白和乳粒蛋白，其中各部分所含蛋白各不相同，乳清蛋白占50％一60％以上，不仅含有丰富的乳铁蛋白和溶菌酶⋯，而且还含有多种与疾病的发生与病变相关的蛋白，它们的组成与含量不仅直接决定其营养价值，其

3、细微结构的变化还能提供某些疾病发生、变化的相关信息J。传统蛋白质的检测主要采用凝胶电泳、等电聚焦、凯氏定氮法、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D—Ge1)、亲和层析(AffinityChromatography，AC)及高效液相色谱分离(HPLC)等方法4。。但此类方法程序复杂，成本高，消耗时间长。具有高分辨率的傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT—ICR—MS)，与肽库配合应用，已经成为生命科学相关领域不可缺少的工具之一_5J。FTr—ICR。MS独特的裂解技术，电子捕获解离(ElectronCaptureDissociation，ECD)不仅可以优先断裂S—s和N～C键，而且还可以进行蛋白质修

4、饰后定位。。根据多肽碎片命名规则并结合碰撞活化解离(CollisionalActivatedDissociation。CAD)CAD和ECD这2种解离方式断裂机理的互补性规律，先将蛋白质酶解成多肽再进行分析，可以提供更多蛋白片段的结构信息，达到100％的覆盖率⋯。，从而提高对蛋白质酶解片段裂解机理鉴定的可信度¨州。本文采用“BottomUp”并结合HPLC和配有Nano—spray技术的高分辨FT．ICR．Ms等方法，在对人乳样品分离与纯化的基础上，将各部分人乳蛋白酶解成多肽片段，首次利用CAD和ECD这2种解离方式断裂机理上的互补性规律，借助Mascot软件数据库，在多肽水平上快速分析

5、并鉴定了人乳样品中乳脂部分、乳清部分和乳粒部分所含蛋白质的组成，并对各部分的差异进行了对比分析。1实验部分1．1试剂和仪器胰蛋白酶，柠檬酸，柠檬酸铵，尿素，DDT，TFA，碘化乙酰胺，乙氰(美国Sigma公司)，丙烯酰胺，s—HCI，溴酚兰，考马斯亮兰(中国华美公司)。其它试剂均为分析纯试剂，实验用水为二次蒸馏水。Waters2695型高压液相色谱(美国Waters公司)，7．0T型傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FTr—ICR．MS)(FinniganLTQFT，德国ThermoBremen公司)，CS380型高速离心机(美国AlfaWassermann公司)。1．2人乳样品的分离人乳样

6、品在一20℃冰箱中保存，实验前取出在室温放置2h后，置于低温高速离心机中离心2009一】2—18收稿，2010-04-04修回吉林省科技厅自求恩医学专项基金(200705391)通讯联系人：石磊，女，博士，副教授；E-mail：shilei@jlu．edu．cn；研究方向：药物化学ll0o应用化学第27卷45min，转速为14000r／min，温度控制在不超过0oC。离心处理后，进行初步的分离，得到乳脂、乳清和乳粒部分，其中乳脂部分在上层，乳清部分在中层，乳粒部分在底部，置于一20℃冰箱中冻存24h后，将各部分分开收集。人乳样品的分离流程参见图1。PatpartPelletpartIlI

7、SDS．PADEHPLCwithSCXcolumnSDS—PADEIIl12samples10samples26sampleslIILC．FT-ICR．MSLC—FT-ICR—MSLC．FT-ICR．MSMS／MSMS／MSMS／MSIIlMascotsearchMascotsearchMascotsearchIIl图1人乳样品的分离示意图Fig．1Separationandpurificationschemeofhumanmilk