D-荧光素体外操作手册.pdf

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1、注：以下翻译仅供参考，最终使用者请以英文原文说明书为准！D-荧光素体外操作手册介绍2+荧光素是一种常用的荧光素酶表达的活体成像生物发光报告子。以ATP和Mg作为辅因子，有氧条件下荧火虫荧光素酶与水溶性底物反应发出一种特有的黄绿色发射光，在37℃活体内转换为红光。该反应通过消耗ATP来指示是否存在能量或生命的存在。由于萤火虫荧光素酶的超灵敏性，快速和易于使用的体系，在研究基因表达方面萤火虫荧光素酶是最常用的报告基因之一。荧光素酶被用来监测细菌，培养细胞和转基因植物或动物的启动子活性反应。荧光素酶是一个61kDa大小的蛋白

2、，它的活性形式是单体，且不需要其它的加工修饰。通过催化荧光素的氧化羧化作用，萤火虫荧光素酶会产生已知的生物发光中最高效的反应之一。荧光素酶活性用来描述与启动子/增强子元件相联的基因调控。通过优化，化学发光反应产生的光和调控元件的转录活性之间存在直接相关性。对于体外报告系统荧光素酶活性的检测，此手册将提供一个简单的，经济可靠的方法。生物发光反应几个因素将会影响反应的灵敏度，包括温度，pH或底物浓度。为得到最佳结果，在使用之前我们建议用pH7.8的缓冲液，并且所有试剂在室温下预热。为充分反应，我们建议在分2+析缓冲液中加入

3、过量的ATP和Mg。当荧光素加入到荧光素酶样品中，会看到瞬间闪光在0.3-0.5秒内达到峰值强度。这光将随着半衰期0.5-1.0分钟左右很快消失。但是初始如果在分析buffer中加入辅酶A，将能阻止快速反应延长半衰期至2-5分钟。如果在反应混合液中后加辅酶A，将促进额外的，次级发光（Fraga,2008）。在GoldBio，我们建议用以YuichiOba,etal.(2003)为基础的荧光素酶分析buffers：-100mMTris-HCl(pH7.8)-5mMMgCl2-250uMCoA-150uMATP(Fraga

4、,2008)-150ug/mld-Luciferin(启维益成)一些研究者在分析buffer中也加入其它成份，比如DTT或EDTA(Steghans,1998)。根据您具体需要可以适当调整分析buffer。为得到最佳结果，根据您具体细胞我们建议先做一个动力学曲线的初步测试。产品具体信息D-荧光素钾盐4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylicacidpotassiumsaltKC11H7N2O3S2分子量：318.42g/molD-荧光素

5、钠盐4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylicacidsodiumsaltNaC11H7N2O3S2.H2O分子量：320.32g/mol储存：-20℃避光保存。材料D-LuciferinsaltforGoldBioLuciferinStockSolution(GLSS)荧光素钾盐（启维益成,G156410）荧光素钠盐（启维益成,G156411）GoldBioLuciferaseAssayBuffer(TMCA)Tris-HCl,p

6、H7.8MgCl2CoenzymeA(CoA)(hydrate)ATP(disodiumsalthydrate)GLSS(GoldBioluciferinStockSolution)2+2+PBS(不含Ca或Mg)细胞裂解buffer荧光素酶（对照）GoldBio荧光素储备液（GLSS）的制备1.用分子生物学级水配成15mg/ml（100×）荧光素储备液a.为最佳结果，荧光素储备液最好现配现用，但如果分成小份储存在-80℃可最长保存一个月。2.在荧光素酶荧光分析中荧光素底物的终浓度应该是：150ug/ml（471

7、uM荧光素钾盐或468uM荧光素钠盐）GoldBio荧光素酶分析buffer（TMCA）制备与TMCA混合之前用分子生物学级水制备所有试剂储备液1.制备500mMMgCl2（100×）溶液a.称取476.05mg（95.21g/mol）的MgCl2，溶于10ml水中。b.溶液储存于室温。2.制备25mMCoA(100×)溶液a.称取191.88mg（767.53g/mol）辅酶A并溶于10ml水中。b.用5-10ml水先预湿0.2um滤膜。c.通过预湿的滤膜滤灭100×辅酶A并存于-20℃。3.制备15mMATP（10

8、0×）溶液a.称取82.67mg（551.14g/mol）ATP并溶于10ml水中。b.存于-20℃。4.制备400mMTris-HCl,pH7.8(4×)buffera.称取4.85g（121.14g/mol）Tris碱并溶于85ml水中。b.用1M的HCl调pH到7.8然后定容到100ml。5.室温下制备新鲜的2×TMCA工作