DB34∕T 3308-2018 两系杂交水稻种子纯度检测 分子标记法.pdf

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1、ICS65.020.99B05DB34安徽省地方标准DB34/T3308—2018两系杂交水稻种子纯度检测分子标记法Protocolforpuritydetectionoftwo-linehybridseeds-molecularmarkermethod文稿版次选择2018-12-29发布2019-01-29实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T3308—2018前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省种子质量监督检验站提出。本标准由安徽省动植物检验检疫标准化委员会归口。本标准起草单位：安徽省种子质量监督检验站、合肥丰乐种业股份有限公司、安徽省种子

2、管理总站、安徽出入境检验检疫局技术中心。本标准主要起草人：周桂林、胡晓玲、吴晓亮、曹玉洁、周贤达、张文晓、范家萌、周锐、周红英、宗凯、张奇、徐丽媛、王凤杰、胡娜、王兆贤、刘根、熊成国、王浩波。IDB34/T3308—2018两系杂交水稻种子纯度检测分子标记法1范围本标准规定了两系杂交水稻种子纯度分子标记检测的原理、实验步骤、结果分析和报告。本标准适用于两系杂交水稻种子纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.1农作物种子

3、检验规程总则GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T1433水稻品种鉴定技术规程SSR标记法3缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：basepair，碱基对CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphates，脱氧核苷三磷酸PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis

4、，聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应SSR：simplesequencerepeat，简单序列重复Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐热DNA聚合酶ddH2O：双蒸水（超纯水）4原理我国生产上两系水稻的不育基因主要为温敏核不育基因tms5，其次为光敏核不育基因pms1、pms3，根据其对应的特征标记在品种中的等位基因型，可判断该品种是否为两系杂交水稻或不育系。同时，水稻的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的重复次数不同的简单重复序列(SSR)，且SSR标记具有共显性，杂交种子具有双亲等位标记互补带型，针对不

5、同品种筛选其区别于其它品种的特征SSR标记，通过SSR多态性分析，可判断受检种子是否为杂交种并区别正常个体与异品种个体。本标准综合利用两系不育基因特征标记和不同品种特征SSR标记，鉴定一定数量送验样品中的正常个体数目或百分率，从而对整体样品的一致程度作出评价。1DB34/T3308—20185仪器设备高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅（30℃～100℃）、核酸蛋白测定仪、组织研磨仪、PCR扩增仪、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、微量可调加样器（2μL、10μL、100μL、1000μL）。6试剂和溶液配制所用试剂均为分析纯，试剂配制用水应符合GB/T6682规定的一

6、级水的要求。6.1试剂6.1.1DNA提取十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠。6.1.2PCR扩增2+引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10×Buffer缓冲液、ddH2O、和Mg或者Mix反应混合液。6.1.3PAGE电泳去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青FF、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠。6.2溶液配制见附录A。7实验步骤7.1取样从送检样品中分取规定数量的试样，试样采用单个个体独立检测。试样的

7、抽取应有代表性，符合GB/T3543.2的规定。试样的检测应设置重复，重复的次数以达到GB/T3543.5规定的容许误差范围内为止，每次重复的数量应至少含有90粒种子。7.2DNA提取7.2.1CTAB法取待检样品的去壳种子、幼苗或叶片约200～300mg置于2.0mL离心管，充分研磨；每管加入700µL经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴30min，期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合液，充分混合后静置10min；10000g离心10min，吸取上清