DB34∕T 2716-2016 两系水稻不育基因鉴定功能标记法.pdf

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1、ICS65.020.01B04DB34安徽省地方标准DB34/T2716—2016两系水稻不育基因鉴定功能标记法Identificationoftwo-linericemalesterilegenes—functionalmarkermethod文稿版次选择2016-09-27发布2016-10-27实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2716—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准归口单位：安徽省农业标准化技术委员会。本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研究所。本标准主要起草人：宋丰顺、杨剑波、倪大虎、倪金龙、陆徐忠、李莉、汪秀峰、魏鹏程、杨亚春、

2、马卉、李浩、秦瑞英、许学、李娟。IDB34/T2716—2016两系水稻不育基因鉴定功能标记法1范围本标准规定了两系水稻不育基因功能标记检测的术语和定义、原理、主要仪器、试剂与溶液、操作步骤、带型记录和结果判定。本标准适用于两系水稻不育基因鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验GB4404.1粮食作物种子第1部分:禾谷类GB/T6682分析实验室用水规格和试

3、验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1功能标记FunctionalMarker根据基因内部引起表型性状变异的功能突变位点开发出来的一种分子标记。3.2两系水稻Two-LineRice本标准将两系不育系和两系杂交水稻统称为两系水稻。两系不育系是指利用水稻的光温敏核不育特性选育的水稻雄性不育系，其在短日低温条件下表现为雄性可育，可以繁殖种子，在长日高温条件下表现为雄性不育，可用于杂交稻制种。两系杂交水稻是指利用两系不育系与恢复系杂交产生的F1代。3.3标准样品StandardSample标准样品是指经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品。本标准中包括阴性标准样品和阳

4、性标准样品。阴性标准样品是指不携带pms3基因和tms5基因的水稻种子、幼叶或DNA。1DB34/T2716—2016阳性标准样品是指携带pms3基因或tms5基因的水稻种子、幼叶或DNA，包括pms3型不育系标准样品、pms3型杂交水稻标准样品、tms5型不育系标准样品和tms5型杂交水稻标准样品。3.4送验样品SubmitSample送到种子检验机构检验的样品。4原理4.1生产上大规模应用的两系水稻按其不育基因种类可分为pms3型和tms5型两类。4.2根据不育基因pms3和tms5的功能突变位点序列与可育基因（PMS3和TMS5）不同，设计引物，扩增功能突变位点，用限制性内切酶

5、特异切割不育基因的扩增产物，而不酶切可育基因的扩增产物，形成片段长度多态，从而将不育基因、可育基因以及两者的杂合体区分开。5主要仪器5.1PCR扩增仪5.2离心机：最大离心力≥12,000g5.3电泳检测系统：水平电泳系统5.4微量移液器：规格分别为2μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，连续可调5.5低温冰箱：最低温度-20℃5.6凝胶成像系统5.7高压灭菌锅5.8电子天平：精确度0.001g5.9恒温水浴锅：温控精确度±1℃5.10磁力搅拌器5.11微波炉5.12紫外分光光度计5.13酸度计：精度±0.01pH6试剂和溶液6.1试剂要求仅使用分析纯试剂和符合GB/

6、T6682规定的一级水。6.2试剂6.2.1十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）6.2.2三羟甲基氨基甲烷碱（Tris-Base）6.2.3乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O）6.2.4浓盐酸6.2.5氢氧化钠6.2.6氯化钠2DB34/T2716—20166.2.7三氯甲烷6.2.8异戊醇6.2.9异丙醇6.2.10无水乙醇6.2.11液氮6.2.12DNA聚合酶及其GCBufferI和GCBufferII6.2.13四种脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），缩略为dNTPs6.2.14限制性内切酶RsaI6.2.15两系水稻不育基因功能标记引物（引物序列见附

7、录A）6.3溶液见附录B。7操作程序7.1样品制备7.1.1送验样品可为水稻的种子、叶片或其他等效物。送验样品为种子时，其分样和保存应符合GB/T3543.2的规定，种子发芽按GB/T3543.4规定执行。7.1.2用于两系水稻类型检测的送验样品，其纯度应符合GB4404.1的规定。随机抽取至少5粒种子（或5个叶片），分别提取基因组DNA。委托方指定的单株叶片，可直接提取DNA。7.1.3用于两系杂交水稻不育株率鉴定的送验样品，应随机抽取至少100粒种子（