全基因组甲基化研究技术小结.pdf

《全基因组甲基化研究技术小结.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、全基因组甲基化研究技术小结DNA甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式。近年来，大量研究表明DNA甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生，起着至关重要的作用。甲基化研究成为表观遗传学的热点，相应的技术也是层出不穷，根据实验目的的不同，这些技术大体能够分成两类：全基因组(高通量)甲基化研究技术以及特异性甲基化位点(低通量)研究技术。下面将介绍几种当前最常用的一些技术全基因组或者说中高通量甲基化研究手段，供大家参考：芯片平台：基于芯片平台的全基因组甲基化分析无疑是性价比最高的甲基化图谱分析方式，目前市场上主流的实验平台主要是illumina和agil

2、ent，相应的产品包括illumina人的商品化芯片(HumanMethylation27DNAanalysisBeadChip,HumanMethylation450DNAanalysisBeadChip)，agilent人和小鼠的商品化芯片(HumanCpGIslandMicroarray，HumanDNAMethylationMicroarray以及MouseCpGIslandMicroarray)，过去RocheNimbleGen也有相应的产品，但从今年下半年已经停产。使用不同的实验平台，操作方法也不同，illumia芯片前期处理采用的是亚硫酸盐处理，将甲基化的差异转变成碱基上的差异

3、，然后利用两个位点特异的探针检测这些化学上差异的位点，一个探针是为甲基化位点(M磁珠类型)设计的，而另一个是为未甲基化位点(U磁珠类型)设计的，结合后通过单碱基延伸掺入一个标记了的ddNTP，通过计算甲基化位点和未甲基化位点掺入的荧光信号强度检测DNA甲基化程度。该项技术被称为Infinium技术，即单碱基延伸技术，包括InfiniumI和InfiniumII，示意图如下：illunina最经典的产品莫过于HumanMethylation27DNAanalysisBeadChip，该芯片含有>27，578个CpG位点，产品性能和评价都很高。不过，随着研究逐步的深入，这款产品已经不能满足研究的

4、需要，慢慢被另一款产品HumanMethylation450DNAanalysisBeadChip取代，包含>450,000个CpG位点，该产品最大的特点在于覆盖范围广，而且除了CpG岛，还涵盖有CpGshores和CpGshlves区域，以及non-CpG位点以及miRNA启动子区域等，无疑是DNA全基因组甲基化研究的又一利器，在对基因组non-CpG位点研究[1]以及在AvonLongitudinalStudyofChildrenandParents(ALSPAC)[2]中都用到这款芯片。而goledengate是illumina的定制芯片平台，适合于样本量大，中高通量的甲基化研究。芯片

5、以矩阵微珠芯片(SentrixArrayMatrix(SAM))的格式，每个panel可以检测96个样本，根据客户的定制要求，每个样品可同时检测384-1536个甲基化位点。而安捷伦采用的是免疫共沉淀的方法(MeDIP-chip)的方法。基因组DNA分成两份，一份用来做MeDIP，加入抗5'-甲基化胞嘧啶核苷抗体,使用免疫磁珠法分离样品中甲基化DNA片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱;另一份作为对照。两个样品都标记荧光(富集的样品input用Cy5标记，对照用Cy3标记)，然后与芯片杂交。芯片上每个探针的Cy5/Cy3强度比例显示出该区域的甲基化程度。agilentHum

6、anCpGIslandMicroarray规格为1x244K，包含约195000个探针检测27800个CpG岛。HumanDNAMethylationMicroarray规格为1x244K，能够检测27627个扩展了的CpG岛(expandedCpGislands)和5081个甲基化不做的区域(UMRregion),MouseCpGIslandMicroarray规格为2x105K，能够检测16030个CpG位点。agilent还有著名的earray平台，能够根据客户要求对芯片进行定制。欧易生物和合作伙伴利用该平台定制了一款专门针对肿瘤相关的芯片，绝大多数基因是针对基因启动子区域的CpG岛设

7、计探针，芯片上一共有4160个功能注释比较明确的基因，其中2128个和肿瘤发生有关系，特别适用于癌症甲基化研究，目前已有相关文献报道[3]。二代测序平台：新一代测序仪的飞速发展，使得测序成本大幅度下降，也使得甲基化组(methylome)的研究成为可能。近两年，多个研究小组利用高通量测序相结合，绘制出了多张甲基化图谱。提到基于二代测序平台的全基因组研究，首先想到的必然是“金标准”BS-seq，即全基因组重亚硫