免疫组织化学染色.pdf

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1、肆、免疫組織化學染色分別將正常組與單側巴金森氏症組之大白鼠進行酪胺酸羥化酶免疫組織化學染色，步驟如下：一、組織固定自動物室取回動物後，以腹腔注射過量chloralhydrate麻醉後，四肢固定於灌流木板上。待無痛覺後，剪開胸腔，剪開右心耳，以蠕動式循環幫浦（Cole-ParmerInstrumentCompany）經由左心室灌流0.9％生理食鹽水，之後再灌流300ml含4％formaldehyde（0.1MPBS；ph:7.4）。灌流固定後，將腦組織取出，浸泡於含4％formaldehyde，及30％蔗糖之0.1MPBS

2、中，作後固定工作，待腦組織完全沈降後，進行冷凍切片（於-20℃下），切片厚度為40μm。二、免疫組織化學染色將腦組織切片附著在已經由0.5％gelatin前處理之載玻片（slides）上，在自然室溫下陰乾。待載玻片乾燥後，將玻片先以0.05M、pH7.6Tris-buffer清洗三次，每次各10分鐘；隨後加入0.1MPBS（含30％normalgoatserum（NGS）與0.4％tritonX-100）作用3027分鐘，以阻斷非專一性結合反應。而後加酪胺酸羥化酶的初級抗體（rabbitanti-bovinetyrosi

3、nehydroxylaseantiserum）於4℃溫度下反應24小時。待24小時後，以0.05MTris-buffer清洗三次，再加入1:100biotinylatedgoatanti-rabbitIgG次級抗體，於室溫下反應一小時後；以0.05MTris-buffer清洗三次後，加入1:100avidin-biotin-peroxidase（ABC）試劑，經室溫下作用一小時後；以0.05MTris-buffer清洗一次。之後加入0.05％DAB及溶於pH7.6、0.05MTris-buffer之0.1％H2O2進行呈

4、色反應10分鐘。用D/W（distwater）清洗三次，每次五分鐘。清洗畢，將玻片烘乾，然後依序以漸進濃度70％（v/v）、90％（v/v）、100％（v/v）之乙醇脫水，以二甲苯進行透明作用，最後滴上封片膠後蓋上蓋玻片，待乾燥後，於光學顯微鏡下觀察。伍、自動放射影像利用核能研究所（InstituteofNuclearEnergyResearch,Taiwan）所備123123製的[I]ADAM，由尾靜脈將注入1mCi/0.5mL之[I]ADAM，在注射後兩小時，以chloralhydrate將動物麻醉後，以斷頭犧牲的方

5、式，迅速切開其顱骨，取出腦部，浸置於乾冰中固化一分鐘，取出已固化之腦部，以OTCcompound包埋在圓形的cryostatholder（直徑2.2cm）上，28