免疫组织化学染色技术研究生

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1、免疫组织化学染色与凋亡检测技术法医学院官大威第二节免疫组织化学染色技术Immunohistochemicaltechnique该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫细胞化学技术。根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：1.免疫酶细胞化学技术2.免疫荧光细胞化学技术3.免疫铁蛋白技术4.免疫金-银细胞化学技术5.免疫电子显微镜技术一、免疫组织化学染色方法的原理抗原（antigen）1.定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。抗原具有两种性能：（1

2、）免疫原性（immunogenicity）指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。（2）反应原性（reactogenicity）指抗原分子与抗体或效应T细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。2.抗原的分类完全抗原、半抗原免疫学分类胸腺依赖抗原与非依赖抗原外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等临床分类同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原抗体（antibody）1.定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。大部分

3、抗体电泳后位于区带，1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。2.抗体的种类:五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是IgG，个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。免疫组织化学染色的反应原理及显色原理1.免疫组织化学染色的反应原理染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位产生肉眼可观察到的颜色，以确定所要检测的抗原是否存在。通过免疫组织化学

4、染色技术，在光学显微镜下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与否。2.免疫组织化学染色的显色原理(1)基本原理荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中以酶标抗体法应用最为广泛。直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠制备的单克隆抗体。第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的第一抗体均来自同一种属

5、动物，与标记的第二抗体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量，可提高免疫组织化学染色的敏感度。IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。（2）显色的基本程序1抗孵育切片或细胞涂片2抗（酶标抗体）孵育切片发色剂显色（核复染）（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）HRP+H2O2HRP·H2O2HRP·H2O2+DH2HRP+D+2H2OHRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使反应的终产物呈现不同的颜

6、色，如：CN（4-chloro-1-naphthol）为蓝色TMB（tetramethyl-benzidine）为深蓝色AEC（3-amino-9-ethyl-carbazole）为红色DAB（3，3-diaminobenzidine）为棕色碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)以AS-Mx（色酚AS-MX磷酸盐）为底物，FB/FR(Fastblue/Fastred)为发色剂，生成蓝色/红色不容性沉淀物。ALP标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。由于组织细胞内含有内源性ALP，在显色液中需加入终浓度为2-4mol/L的左旋咪唑(

7、levamisole)，大多数内源性ALP活性可被抑制。葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS(吩嗪硫酸甲酯,phenazinemethyl-sulfate)0.167mg、0.05mol/LPBS(pH8.2)10.0ml，37ºC孵育1小时，生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片可经脱水、