第七讲 免疫组织化学染色原理和方法

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1、第七讲免疫组织化学染色原理和方法一、免疫组织化学染色方法的分类根据染色在整个制片中的位置：包埋前染色、包埋后染色；根据标记物的种类：免疫荧光法（即荧光抗体法）、免疫过氧化物酶法（即过氧化物酶抗体法）、免疫铁蛋白法（即铁蛋白抗体法）、免疫胶体金法（即胶体金抗体法）；按标记物的位置：直接法（标记物结合在直接与组织抗原发生免疫结合的特异性抗体、即第一抗体上）、间接法（标记物通过其所标记的非特异抗体，即第二抗体间接地与第一抗体结合）及各种标记物一抗体复合物法（包括标记物一非抗体复合物法）。直接法(一步)抗原荧光色素一抗间接法(两步)桥法(四步)PAP法

2、(三步)ABC法(三步)ABC复合物PAP复合物生物素二抗一抗抗原抗原一抗二抗二抗一抗三抗Fc一抗抗原荧光色素二抗HRP羊一步法染色步骤简捷，特异性强，但敏感性较差，且标记抗体适用范围窄；二步及多步法经抗体放大，敏感性明显提高，标记抗体可一标多用，但染色步骤多、耗时，特异性不如直接法。免疫标记技术根据实验中使用标记物与检测方法不同，标记技术可分为：免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶标技术、发光免疫分析、免疫电镜技术。二、免疫组织化学染色的原理免疫组化染色是引入附有标记物的外源性抗体（或抗原），使之锚定于组织或细胞标本中相应的抗原（或抗体）部位，

3、标记物经呈色反应而显示待检抗原（或抗体）。（一）免疫荧光技术用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原（或抗体）进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察实验结果，或是应用流式细胞术进行自动分析检测；用于检测体液标本中抗原或抗体，即荧光免疫测定。1.免疫荧光显微技术直接法：把荧光素直接标记在特异性抗体（第一抗体）上其优点是特异性强，操作时间短，但敏感度低，而且需要多量的抗体。间接法：把荧光色素标记到第二抗体上，所谓第二抗体就是第二种动物抗产生特异性抗体的第一种动物IgG的抗体。ImmunofluorescenceexperimentsThi

4、simmunofluorescencemicrographshowstheERbeinglabeledwithamonoclonalantibodyagainstthethechickencalciumATPase.Thischickencellwasfixed,permeablilized,andprocessedforimmunofluorescence.WhiteindicatesthelocationofthefluorescentantibodyandthusthecalciumATPasetowhichtheantibodywasb

5、ound.ImmunofluorescencephotomicrographbyA.MalcolmCampbell.间接法与直接法相比，有两个突出的优点标记的第二抗体可通用于多种抗原的定位；敏感度大为提高。因为每个抗原分子可以与1个以上的抗体分结合，假设组织抗原分子与4个第一抗体分子结合，每个第一抗体（作为第二抗体的抗原）分子又与5个第二抗体分子结合。在直接法中，一个抗原分子只能连接4个标记物分子，而在间接法中，一个抗原子连接了20个标记分子。抗原分子连接的标记物分子越多，发色强度越大，敏感度也愈高。操作步骤切片脱蜡、入PBS。冰冻切片则直接入

6、PBS。滴数滴第一抗体，使其扩布于整个组织表在。将载片放入润盒中，在4℃下放置12—24小时，或在37℃下放置30—90分钟，使发生抗体抗原反应（以下操作均在湿盒内进行）。用室温的PBS充分洗净，换液3—4次，15分钟。滴数滴萤光色素标记的第二抗体，在37℃下反应30—45分钟。用PBS充分洗净。用无荧光甘油和PBS（3:1）的混合液封盖，在荧光显微镜下观察。假如不能马上观察，可暂时放入4℃冰箱中保存（切片应）处于水平状态）或放入-20℃冰箱中冰冻保存。补体结合免疫荧光法双标记法DrainoffPBSwithanyoftheabovementi

7、onedfixationmethods.WashinPBS3-times5min.Permeabilizewith0.01%TritonX-100inPBSfor30sec(ifneeded).WashinPBS3-times5minIncubatein1%BSA,PBSpH7.5for30mintoblockunspecificbindingoftheantibodies.(alternativeblockingsolutionsare:1%gelatine,1%bovineorhorseserum)Incubatewithprimaryan

8、tibodyin1%BSA,PBSpH7.5for60min(orovernightatr.t.dependingonantibodyconcentr