人脑胶质瘤原代细胞培养及形态学观察

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1、中国神经精神疾病杂志2010年第36卷箜501·论著·人脑胶质瘤原代细胞培养及形态学观察檀艳丽方川王雷鸣由江峰刘书哲钟延丰【摘要】目的探讨人脑胶质瘤原代细胞培养的有效方法，建立理想的胶质瘤细胞体外试验模型。方法采用组织块培养法对22例人脑胶质瘤进行原代细胞培养，倒置显微镜下观察肿瘤细胞的形态学特点，通过四甲基偶氮噻唑蓝(Mrrr)法绘制生长曲线，研究体外培养细胞的生长情况。利用细胞免疫组织化学染色的方法检测胶质纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)及Ki67

2、的表达，鉴定培养的细胞。结果脑胶质瘤细胞原代培养2l例成功，1例失败；培养成功的细胞贴壁生长，形态各异，生长状态好，有明显的对数生长期，并可传代培养。各级别原代培养细胞吸光度值差异有统计学意义(P<0．05)，恶性程度越高，细胞增殖越快。细胞GFAP表达阳性，证明培养的细胞为胶质瘤细胞。结论组织块培养法适合于体外胶质瘤细胞原代培养，通过此方法可以建立理想的胶质瘤细胞体外试验模型。【关键词】胶质瘤原代培养形态学免疫组化【中图分类号】R739．41【文献标识码】A人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的一组肿瘤。

3、原代培养初期组织块周同原代胶质瘤细胞与传代后细胞生长情况、形态学的脑胶质瘤细胞保留原来的遗传特性，最接近和反映体内生长特特点并进行拍照。性，是理想的基因表达和药物毒性体外试验模型。本研究采用组1．4免疫组织化学染色鉴定细胞性质取对数生长期的细胞悬织块培养法进行人脑胶质瘤原代细胞培养并观察其形态，探讨人液滴加在多聚赖氨酸处理的无菌载玻片上，待细胞爬满载玻片脑胶质瘤原代细胞培养的有效方法。后，细胞经冷丙酮固定15min，采用细胞免疫组织化学sP法对培养细胞加以鉴定，一抗分别为鼠抗人GFAP单克隆抗体和Ki

4、671资料与方法单克隆抗体(试剂购自福州迈新生物有限公司)。GFAP以胞浆1．1临床资料2009年4～9月收集河北大学附属医院神经外呈棕黄色为阳性细胞。Ki-67以细胞核呈棕黄或棕褐色为阳性细科22例胶质瘤患者(所有病例均经病理学证实且术前、术中均未胞，在高倍镜(400X)下随机选取10个视野，计数约1000个肿瘤使用化疗药物)手术切除的新鲜标本，所有胶质瘤标本征得患者细胞计算阳性肿瘤细胞所占的百分率。或家属的知情同意，并取得河北大学附属医院伦理学委员会批1．5MTT比色法绘制生长曲线原代胶质瘤细胞调

5、整细胞悬准。其中男9例，女13例，年龄8～76岁，平均年龄44．5岁。按液浓度为10个／mL，200L／孔接种于96孔板，每组细胞接种6照WHO(2007)中枢神经系统肿瘤分类标准⋯：星形细胞瘤9例个孔，每隔24h监测一组，连续检测7d。酶联免疫检测仪存570(Ⅱ级)，间变性星形细胞瘤l0例(Ⅲ级)，胶质母细胞瘤3例(Ⅳnm波长处测定光吸收值(OD值)，OD值以均值±标准差(±s)级)。表示，以时间为横坐标，6孔平均OD值为纵坐标，绘制细胞生长1．2组织块法进行人脑胶质瘤细胞原代培养手术切除的新鲜曲线

6、。读取各例第4dOD值，检测细胞增殖活力，分析与病理级肿瘤标本，立即放人无菌DMEM培养液中常温送实验室。肿瘤别的关系，检测重复3次。组织用含有青霉素、链霉素的DMEM培养液冲洗3次，放入无菌1．6统计学分析应用SPSS16．0统计软件，采用方差分析及青霉素小瓶中加少量培养液，用眼科剪刀剪成体积大小约0．5LSD检验进行组问比较，检测水准=0．05。UIUI组织，吸管吹打使之松散，吸取组织块于人培养瓶，加入含2结果10％胎牛血清的DMEM高糖培养基6niL，放入37℃恒温、5％CO，培养箱内培养。观察

7、肿瘤细胞从组织块边缘向外移行生长2．1原代胶质瘤细胞生长状况及形态学表现脑胶质瘤原代细情况。按照细胞生长情况更换培养液，初次半量更换培养液。当胞培养21例成功，1例因污染失败。肿瘤细胞从组织块爬出的细胞长满瓶底后，以1：2的比率传代至另一培养瓶，继续培养。时间不同，最早培养4h即可见细胞以组织块为中心从边缘爬1．3原代胶质瘤细胞形态学观察倒置相差显微镜下观察培养，晚者7d见细胞长出。原代胶质瘤细胞围绕组织块呈放射状排列，“铺路石样”生长。瘤细胞呈贴壁生长，状态良好的细胞联河北省科学技术研究与发展计划项

8、目(编号：06276102D-20)；河络呈片状。原代瘤细胞形态各异，呈梭形、i角形、多角形等多种北省科学技术研究与发展计划项目资助(编号：072761O1D-79)形态，细胞轮廓清楚，胞浆均质透明，核圆形，单核或多核，核f二{河北大学基础医学院(保定071000)大、l～2个，清晰可见(图1)。。通讯作者(E—mial：zhongyf@bjmu．edu．CII)2．2胶质瘤细胞的鉴定胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化河北大学附属医院染色阳性的细胞，胞