食品生物技术重点.doc

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1、食品生物复习重点基因工程:又称分子克隆或重组DNA技术，用酶学方法，将异源基因与载体DNA在体外进行重组，将形成的重组子DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需要的生物品种和产物。操作步骤：①采用酶切cDNA文库人工合成或PCR扩增，分离制取目的基因片段②采用核酸限制性内切酶II同时剪切目的基因和克隆载体③在T4DNA连接酶的作用下将目的基因与载体基因连接而成重组DNA④把重组DNA分子导入受体细胞，并在一起扩增而成克隆子⑤标记分析和筛选出获得重组DNA分子的克隆受体细胞⑥进一步扩增、转化和表达，最终生成新的

2、优良性状的菌种或人类所需要的产品。工具酶:在基因工程中应用的酶统称工具酶，是基因工程操作中不可缺少的工具。限制性内切蘭:是一类专一性很强的核酸内切酶。它与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性及对磷酸二酯键的断裂方式有所不同，这些酶在基因分离、DNA结构分析、载体的改造及体外重组中均起着重要作用。种类:1型蘭:分子质量较大,是一类复杂的多功能酶，作用时需要Mg2+、ATP和S■腺昔酰甲硫氨酸等辅助因子。能切割未修饰的DNA但切口识别序列特异性差。川型酶：属双功能酹，有两种不同亚基，识别位点无规律，也许辅助因子。I型酶与山型酶在基因工程中应用价值低，II

3、型酶：分子质量较小，简单单功能酶，作用时无需辅助因子只需镁离子，能识别双链DNA上特异的核昔酸序列，专一性强，识别序列与切割序列一致，适合于基因工程操作，其中E.coRI应用最广。限制荫的命名：以宿主微生物属名的头一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）写成斜体字的三个字母的缩写。菌株名以非斜体符号加在这三个字母的后面。若同一株中有不同的限制性内切酶时则一罗马数字区别。限制酶作用方式：机制：以环状和线形双链DNA为底物，在一定条件下识别一定的核昔酸序列，在两条链的特点硫酸二酯键上催化切开。作用方式及识别位点①识别不同特异核昔酸序列②识别序列皆具有回文结构③切割后形

4、成各种黏性末端或平整末端④切割后形成异源二聚体。DNA连接酶：是外源目的基因片段与载体质粒DNA片段在体外连接形成重组DNA分子或称为杂合子。能催化DNA分子中相邻的3'・OH末端和5=磷酸基末端之间形成磷酸二酯键，即能封闭双链DNA上相邻核昔酸之间的单链缺口，常用：T4-DNA连接酶。DNA聚合爾I:作用是催化聚合脱氧核昔酸，使之逐个接到引物上去，最后形成新的DNAo主要用来做DNA探针的体外标记，即缺口翻译，也用于酶法测定DNA顺序。碱性磷酸酯酶：催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5=磷酸残键，即脱磷酸作用。在基因工程中主要是应用该酶处理经限制性核酸内切酶

5、切割后的载体DNA,去除载体DNA两末端的5、磷酸残键，以防止载体DNA自我环化，提高重组效率。T4多聚核核昔酸激蘭:主要作为DNA5，・末端标记，标记待测DNA片段。S1核酸酶：对单链DNA或RNA具有特异性的核酸外切酹，产生5'-磷酰基的单核昔酸或寡核昔酸，但不能降解双链的DNA或RNA的杂合子。用来分析DNA-RNA杂合子结构。反向转录II:能以RNA为模板反向转录后形成双链DNAo目的基因：（靶基因、外源基因）：按照人们预先设计的蓝图，获得所需要的特异基因。制取方法：4.生物学方法（①鸟枪射击法或滔弹散射法（适用于原核生物），快速简便、产物纯度高②分子杂交，

6、根据碱基配对原理）2.化学合成法（以单核昔酸为原料，在体外按已知基因的碱顺序合成DNA片段，需先知核昔酸或氨基酸的序列）3.基因文库法（适用于真核生物，基因文库：用克隆方法将一种生物全部基因组以重组体的方式长期保持在适当的宿主中。CDNA文库构建步骤：①酶促合成法制取cDNA②从组织或细胞中制备总RNA和mRNA③合成cDNA第一条链④cDNA第二条链的合成⑤双链cDNA与载体DNA的连接）4.PCR扩增法（PCR扩增法（聚合酶链式反应）：是—种用在体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的分子生物学技术。步骤①使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链②在低温下与两

7、个引物进行退火，使引物与单链DNA配对结合③在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定行进行聚合（延伸）反应④经过3个不同温度的重复循环，约经过30次后可增至10的六次方倍。）基因载体：目的基因的运载体，具有自我复制能力的质粒DNA,主要是质粒、病毒和噬菌体。应具备的条件①本身是一个复制子，能自我复制②相对分子质量小，小分子DNA易处理，限制内切酶切点少，适于接受目的基因③能给宿主细胞提供选择标记，有可供辨认的表型特征，以便人们进行筛选④只有单一限制性内切酶切点，经某一限制性内切酶切割后，既可以把质粒DNA闭环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。